New Approaches on Hypoxic-Ischemic Encephalopathy: Translational research to diagnose and monitor stem cell therapy

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Caramelo, Inês Isabel Nunes
Data de Publicação: 2025
Idioma: eng
Título da fonte: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/10316/118432
Resumo: Tese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação Interdisciplinar
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spelling New Approaches on Hypoxic-Ischemic Encephalopathy: Translational research to diagnose and monitor stem cell therapyNovas Abordagens em Encefalopatia Hipóxico-Isquémica: Investigação translacional para diagnosticar e monitorizar resposta a terapia com células estaminaiscélulas estaminais mesenquimaisencefalopatia hipóxico-isquémicafisióxiamecanomodelaçãoproteómicahypoxic-ischemic encephalopathymechanomodulationmesenchymal stem cellsphysioxiaproteomicsCiências exactas e naturais::Ciências biológicasTese de Doutoramento em Biologia Experimental e Biomedicina apresentada ao Instituto de Investigação InterdisciplinarHypoxic-ischemic encephalopathy is one of the leading causes of child death worldwide, and it is caused by an episode of perinatal asphyxia, which interrupts the blood supply to the brain. Due to its high energy demands, this interruption initiates glutamate excitotoxic pathways, leading to cell death. Most of the survivors develop various neurological diseases, such as cerebral palsy, seizures, and/or motor and behavioral problems. Presently, therapeutic hypothermia is the current standard of care for term newborns, but its efficacy is far from ideal. Umbilical cord mesenchymal stem cells (UC-MSCs) are gaining attention as a promising complement to the current clinical approach. However, obtaining minimal effective doses requires an extensive in vitro expansion, which compromises their therapeutic properties.UC-MSCs can sense and respond to biomechanical and chemical characteristics of the microenvironment. In the umbilical cord, the stiffness ranges between 2 and 5kPa, and the oxygen levels fluctuate from 2.4% to 3.8%, differing from the conventional in vitro culture conditions where MSCs are exposed to the stiffness of the Petri dish (2-3 GPa) and near atmospheric oxygen levels (18.5%O2). Therefore, it was hypothesized that expanding UC-MSCs on 3kPa platforms – mechanomodulation – or at 5%O2 levels – physioxia – could potentially impact the cellular proteome of readapted or primed UC-MSCs, for long (7-10 days) or short (48h) periods, respectively. Data analysis has unveiled that culturing MSCs on soft substrates for long periods promotes the expression of various proteins related to cell redox homeostasis. Conversely, culturing these cells during the same period but under low oxygen levels increases chaperone machinery proteins. These proteins can favor the clearance of misfolded proteins, possibly preventing MSCs from being driven to a senescent phenotype. Although mechanomodulation and physioxia are two distinct stimuli, both converge in downregulating the expression of histones and several ribosomal subunits, probably decreasing translational complexity. Interestingly, priming UC-MSCs leads to a differential expression of extracellular matrix proteins, suggesting that the secretome composition might also be altered in response to physiological cues. To explore this hypothesis, proteomic characterization of the secretome of UC-MSCs primed or readapted to soft or low oxygen levels was performed. Maintaining UC-MSCs on soft platforms for long periods increased the secretion of proteins associated with cell redox homeostasis, while physioxia enhanced the secretion of immunomodulatory proteins. The high secretion of these proteins might confer a therapeutical advantage by favoring a regenerative environment at the injury site. Interestingly, lowering the stiffness or oxygen converged on the downregulation of several extracellular matrix proteins (ECM) on primed and readapted cells. These results suggest that a massive reorganization of the extracellular space occurs upon culturing MSCs on conventional culture conditions, which may affect several signaling pathways initiated at the cell membrane, such as PDGF signaling pathways, consequently biasing stem cell fate. Since using the secretome as a cell-free therapy is raising interest and offers the advantages of being readily commercialized as an off-the-shelf product without immunogenicity compatibility issues, these data support that mimicking physiological culture conditions in vitro may empower its therapeutical properties.Therefore, to evaluate how physiological culture conditions could impact the therapeutic potential, physiologically primed UC-MSCs or their secretome were added to an in vitro HIE model using cortical neurons' primary cultures subjected to oxygen and glucose deprivation (OGD) insult. The treatment with the secretome of UC-MSC modulated under physioxic conditions sustained part of the neuronal network integrity and modulated several mitochondrial proteins. This suggests that the unique composition of the physioxia-modulated secretome may offer a therapeutical advantage in restoring essential cellular processes that help neurons maintain their function, compared to traditionally expanded UC-MSCs. Nevertheless, proteins whose levels were restored in the presence of UC-MSCs or their secretome were mainly involved in the re-establishment of the levels of proteins involved in translation mechanisms possibly stabilizing proteostasis, which is known to be essential for neuronal recovery. Understanding how transducing environmental cues might provide insights into how conventional culture conditions significantly alter fundamental cellular processes and support the development of a more efficient expansion protocol. Consequently, this might empower the therapeutic potential of UC-MSCs and their secretome and improve treatment outcomes compared to conventional culture conditions.A encefalopatia hipóxico-isquémica é uma das principais causas mundiais de morte infantil, ocorrendo após um episódio de asfixia perinatal que interrompe o fluxo sanguíneo no recém-nascido. Devido às elevadas necessidades energética do cérebro, o que leva à morte neuronal mediada pela excitotoxicidade por glutamato. Frequentemente, os recém-nascidos que conseguem sobreviver desenvolvem doenças neurológicas. Atualmente, a hipotermia terapêutica é o tratamento aplicado a recém-nascidos de termo. Contudo, a sua eficácia está longe de ser ideal. Neste sentido, as células estaminais mesenquimais do cordão umbilical (UC-MSCs) surgiram com um tratamento complementar. No entanto, a obtenção de doses mínimas eficazes requer uma expansão in vitro exaustiva, o que compromete as suas propriedades terapêuticas.As UC-MSCs têm a capacidade de responder às características biomecânicas e químicas do ambiente. No cordão umbilical, a rigidez varia entre 2 e 5kPa, e os níveis de oxigénio flutuam entre 2,4% e 3,8%, condições bastante distintas das condições convencionais de cultura in vitro onde as UC-MSCs são expostas à rigidez da placa de Petri (2-3GPa) e a níveis de oxigénio próximos dos atmosféricos (18,5%O2). Assim, explorou-se a hipótese que expandir UC-MSCs em plataformas de 3 kPa – mecanomodulação – ou a níveis de 5%O2 – fisioxia – poderia potencialmente alterar o proteoma celular das UC-MSCs, por períodos longos (7-10 dias) ou curtos (48 horas), respetivamente. A análise dos dados revelou que a expansão de UC-MSCs em substratos menos rígidos por períodos prolongados promove a expressão de várias proteínas relacionadas com a homeostasia do estado redox. Por outro lado, a cultura destas células em níveis de oxigénio fisiológicos durante o mesmo período leva ao aumento de proteínas da maquinaria das chaperonas, podendo favorecer a eliminação de proteínas sem conformação correta, o que leva à prevenção da senescência. Estes estímulos distintos convergiram na diminuição da expressão de histonas e de várias subunidades ribossomais, o que pode estar associado a uma menor complexidade translacional, e consequentemente um fenótipo indiferenciado. Foi ainda identificada uma expressão diferencial de proteínas da matriz extracelular, sugerindo que a composição do secretoma poderia também estar a ser afetada.Para explorar esta hipótese, frealizou-se uma caracterização proteómica do secretoma de UC-MSCs mantidas por períodos longos ou curtos em substratos menos rígidos ou níveis de oxigénio fisiológicos. A manutenção das UC-MSCs em plataformas menos rígidas durante períodos longos aumentou a secreção de proteínas associadas à homeostasia do estado redox, enquanto a fisioxia aumentou a secreção de proteínas imunomoduladoras. A elevada secreção destas proteínas pode favorecer um ambiente regenerativo no local da lesão. Além disso, a redução da rigidez ou dos níveis de oxigénio convergiu na diminuição da secreção de várias proteínas da matriz extracelular. Estes resultados sugerem que ocorre uma reorganização do espaço extracelular quando as UC-MSCs são cultivadas nas condições de cultura convencionais, o que pode afetar não só a rigidez da matriz, mas também várias vias de sinalização iniciadas na membrana celular, enviesando o estado de diferenciação das UC-MSCs. O uso do secretoma como uma terapia oferece vantagens de comercialização, e por isso estes dados sugerem que a mimetização de condições fisiológicas in vitro pode potencializar as suas propriedades terapêuticas.Para avaliar se a mimetização das condições fisiológicas na cultura de UC-MSCs tem impacto no seu potencial terapêutico, as células sujeitas a estas condições por períodos curtos, ou o seu secretoma, foram adicionados a um modelo de HIE in vitro utilizando culturas primárias de neurónios corticais submetidas a uma condição de privação de oxigénio e glicose. O tratamento com o secretoma de UC-MSCs modulado sob condições fisióxicas manteve parte da integridade da rede neuronal e modulou várias proteínas mitocondriais. Isto sugere que a composição única do secretoma modulado por fisioxia pode oferecer uma vantagem terapêutica ao restaurar processos celulares essenciais, em comparação com UC-MSCs expandidas nas condições convencionais. Foi ainda possível identificar proteínas cujos níveis foram restabelecidos com o tratamento estavam principalmente envolvidas no restablecimento da homeostasia das proteínas, o que é fundamental para a recuperação neuronal.Compreender como a conversão de sinais do ambiente para vias de sinalização pode esclarecer sobre como as condições convencionais de cultura alteram significativamente processos celulares fundamentais. Desta forma, será possível o desenvolvimento de um protocolo mais eficiente para proliferação destas células, sem impactar a perda das suas propriedades durante a expansão, levando a uma melhoria dos resultados dos tratamentos em comparação com as condições de cultura convencionais.FCT2025-02-26doctoral thesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttps://hdl.handle.net/10316/118432https://hdl.handle.net/10316/118432TID:101678673engCaramelo, Inês Isabel Nunesinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-20T23:00:48Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/118432Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T06:12:36.105598Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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