Caracterização cinética de uma ATP-difosfohidrolase em membranas de placa óssea de rato livres de fosfatase alcalina

• Ano de defesa: 2001
• Autor(a) principal: Baptistella, Marlene Aparecida Demenis
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Bone plaque; Mineralização; Mineralization; Placa óssea; Ratos; Rats
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-02082023-152231/

Membranas de placa óssea de rato foram preparadas a partir de implante de pó de osso desmineralizado no tecido subcutâneo de ratos Wistar e purificadas em coluna de Sepharose 4B (Cell. Mol. Biol. 32: 55, 1986). A remoção da fosfatase alcalina das membranas foi feita com fosfolipase C específica para fosfatidilinositol (Biochim. Biophys. Acta 1368: 108, 1998) e a atividade de nucleotídeo fosfatase determinada a 37°C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo MgCl22 mM, teofilina 5 mM, em um volume final de 1 mL. Durante o processo de purificação das membranas livres de fosfatase alcalina, a razão entre as velocidades de hidrólise do ATP e do ADP permaneceu constante (da ordem 2,4) sugerindo que elas correspondem a uma mesma enzima. O mesmo perfil de pH foi observado para a hidrólise do ATP e ADP e o pH ótimo aparente é 7,5. Estudos de competição de substratos mostrou que, independentemente da relação entre as concentrações de ATP e ADP presentes no meio reacional, as atividades específicas sempre similares sugerem inequivocamente que a hidrólise do ATP e ADP representam reações competitivas para um único sítio na enzima. Uma significativa inibição da hidrólise do ATP e ADP pela enzima foi observada na presença de azida de sódio, um inibidor de apirases, em concentrações que variaram entre 2,5 mM (ADP) e 7,5 mM (ATP). Os valores dos parâmetros cinéticos calculados para a hidrólise dos diferentes substratos pela enzima mostram que a atividade NTFase é quase duas vezes maior que a correspondente NDFase enquanto a NMFase é nula ou desprezível. A preparação não está contaminada por fosfatases não específicas, ATP-pirofosfatase (EC 3.6.1.8), pirofosfatase inorgânica (EC 3.6.1.1), fosfodiesterases, adenilato quinase e proteína fosfatases. Em condições saturantes de ATP e magnésio, a atividade das membranas livres de fosfatase alcalina não é inibida pela oligomicina, ouabaína, bafilomicina A1 tapsigargina, omeprazol, ácido etacrínico e AP5A. Entretanto, a velocidade de hidrólise do ATP e ADP é reduzida cerca de 30% e 40%, respectivamente, na presença de suramina 1 mM, um antagonista do receptor de purina P2. Na ausência de íons magnésio ou cálcio, a hidrólise do ATP e ADP é desprezível enquanto na presença de íons cálcio ou magnésio a estimulação da atividade da enzima por tais íons é similar e cada íon pode substituir o outro durante o ciclo catalítico da enzima. A hidrólise do ATP e ADP diminuiu consideravelmente na presença de Polidocanol 1%, Lubrol WX 1,35%, Lubrol PX 1%, CHAPS 2,5%, C12E8 1%, Triton X-114 1%, Triton X-100 0,2%, n-octil-β-D-glicosídeo 30 mM, polioxietileno-5-decil éter 0,5%. Os resultados mais promissores foram obtidos com a adição conjunta de digitonina e dimiristoil L-α-fosfatidilcolina (DMPC). Dentre todos os detergentes utilizados, a digitonina, na proporção de 5:1 (mg/mL) foi mais eficaz na solubilização. A ATPase existente na membrana de placa óssea de rato e livre de fosfatase alcalina pode ser considerada uma ATP-difosfohidrolase por apresentar especificidade para nucleotídeos di e trifosfatos; não hidrolisar nucleotídeos monofosfato e fosfomonoésteres não nucleotídeos; ser ativada por íons cálcio ou magnésio; não ser inibida pelos inibidores de V-, Ca2+-, H+-, e Na+ ou K+-ATPases; ser inibida por altas concentrações de azida de sódio; apresentar a mesma faixa de pH para NTF e NDF; ser facilmente inativada por detergentes; apresentar valores similares de Km (100 µM) para o ATP e ADP.