Desenvolvimento de uma estratégia de inibição de transportadores ABC utilizando anticorpos.

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Guerra, Gabriel Soares
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Inibição mediada por anticorpos; Escherichia coli; Staphylococcus aureus; ABC transporters; Antibody mediated inhibition; Membrane protein; Proteína de membrana; Transportadores ABC
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-08122021-170452/

Transportadores do tipo ABC (do inglês ATP Binding Cassette), estão entre os principais complexos proteicos responsáveis pelo fluxo de moléculas contra um gradiente de concentração pela membrana plasmática. As funções atribuídas à esta família proteica vão desde o transporte per se, como nutrição, virulência, patogênese até resistência à drogas, em procariotos e eucariotos. Devido à pluralidade de funções, tais complexos têm sido alvo de extensos estudos para a compreensão do seu papel, funcional e estrutural, nos mecanismos de resistência. Transportadores ABC do tipo importadores, presentes somente em procariotos, são constituídos de duas permeases formadoras de um poro na membrana, duas ATPases que fornecem energia para a quebra do ATP e um componente adicional quando comparado aos exportadores, que é uma proteína ligadora de substrato responsável pela captura e entrega do substrato a ser transportado nas permeases na membrana. Esta interação é essencial e fundamental para a especificidade e velocidade do transporte, além de induzir mudanças conformacionais que ativam o transporte. Sem a interação da proteína ligadora, não há transporte. Baseados neste dado e no fato que importadores estão presentes somente em procariotos, este projeto visa definir um modelo de inibição dessses sistemas baseado na produção de anticorpos contra diferentes transportadores ABC das bactérias Escherichia coli e Staphylococcus aureus de forma a bloquear a interação entre permeases e proteínas ligadoras de substrato. Para tal, regiões de permeases que devem interagir com as proteínas ligadoras foram expressas utilizando o sistema Rad Display para posterior produção de anticorpos contra as mesmas. Neste sistema, as sequências de interesse foram extensivamente analisadas por bioinformática e posteriormente clonadas no interior do gene radA de Pyrococcus furiosus, sendo expressas como proteínas quiméricas sempre solúveis. As proteínas, doravante denominadas RAD-loops, foram então purificadas por meio de cromatografia de troca catiônica seguida de exclusão molecular e usadas para produção de anticorpos. Ensaios de ELISA indireto foram realizados para determinar o título de anticorpos nos soros de animais imunizados com as proteínas Rad+loop e, posteriormente, uma série de ensaios incluindo western blotting, whole cell elisa e imunofluorescência caracterizaram a interação dos anticorpos com seus respectivos alvos ABC. Por fim, foi realizado ensaio de inibição utilizando meio mínimo de crescimento na presença das igGs para determinar a influência das mesmas no crescimento bacteriano. Os resultados apresentados neste trabalho são de grande importância uma vez que são inéditos devido ao uso de permeases como alvo para inibição de ABCs, o que será extremamente relevante para o desenvolvimento de novas estratégias que visem bloquear ação desses complexos proteicos vitais para a manutenção da homeostase celular e vastamente disseminados tanto em procariotos como eucariotos.