Caracterização fisiológica e genética do transporte de arginina em Leishmania (Leishmania) amazonensis

• Ano de defesa: 2011
• Autor(a) principal: Martins, Emerson Augusto Castilho
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Amino acid transport; Fisiologia da relação parasita-hospedeiro; Physiology of host-parasite interaction; Transporte de aminoácido
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41135/tde-26042011-153538/

Protozoários do gênero Leishmania são parasitas digenéticos, com uma fase no tubo digestório de um hospedeiro invertebrado (promastigota), e uma fase parasita intracelular de macrófagos (amastigotas). Estudar a demanda de L-arginina no parasita é interessante, uma vez que o aminoácido é indispensável para a sobrevida do parasita e, ao mesmo tempo, serve de substrato para a produção de óxido nítrico, principal composto microbicida dos macrófagos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o transporte de arginina em Leishmania (Leishmania) amazonensis do ponto de vista fisiológico e caracterizar o gene que codifica o transportador do aminoácido, bem como a regulação da sua expressão em resposta a diferentes condições biológicas. Para medir o influxo de L-arginina em fagolisossomos, utilizamos macrófagos J774 infectados com L. (L.) amazonensis e desenvolvemos uma metodologia com citometria de fluxo com sorting para a purificação da organela. Validamos microscopicamente a presença do parasita na organela por sua fluorescência, e avaliamos a integridade da membrana externa dessa com marcador de pH ácido. Paralelamente, o gene que codifica o transportador de arginina do parasita foi caracterizado. Foram encontradas duas cópias em tandem que produzem dois transcritos (5.1AAP3 e 4.7AAP3), cujas regiões 5\'UTR e 3\'UTR são diferentes. Por meio de PCR quantitativo em tempo real, avaliamos a expressão desses transcritos e verificamos que 5.1AAP3 é mais expressa ao longo do desenvolvimento do parasita, com um máximo em fase estacionária. A determinação da meia-vida dos mRNA das duas cópias indicou uma duração de 32,6±5,0min para o mRNA de 4.7AAP3, enquanto que o de 5.1AAP3 não apresentou decaimento até 180min do estudo, evidenciando que a estabilidade maior pode ser a razão de sua maior abundância. A submissão de parasitas à privação de arginina levou a aumento na tomada do aminoácido concomitante ao aumento do transcrito 5.1AAP3. Mutantes nulos de arginase submetidos à privação de arginina respondem com uma taxa de incorporação mais baixa em relação aos parasitas selvagens, e mantém a resposta à privação mesmo com os parasitas em fase estacionária, diferente do observado nos parasitas selvagens. Esse conjunto de resultados nos levou a sugerir que a expressão do transportador pode ser regulada pela estabilidade do mRNA, e que o pool de arginina interno ao parasita pode controlar, num mecanismo de retroalimentação negativo, a expressão de seu transportador.