Biologia estrutural e busca por inibidores da proteína não-estrutural NS5 domínio RNA polimerase dependente de RNA do vírus Zika

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Oliveira, Ketllyn Irene Zagato de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Flavivirus; Flavivírus; NS5 RNA-dependent RNA polymerase domain; RNA polimerase dependente de RNA; Zika vírus
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-03092021-112443/

O vírus Zika (ZIKV) é um membro da família Flaviviridae que teve a primeira ocorrência relatada no Brasil em abril de 2015. O maior impacto do ZIKV ocorreu devido a sua associação com o aumento no número de casos de microcefalia em bebês e fetos de gestantes infectadas com o vírus durante a epidemia que ocorreu no Brasil entre 2015 e 2016. Desde então, mais de 240.000 casos de febre Zika foram notificados no país, sendo 10.768 casos registrados no ano de 2019 e 6.705 casos prováveis no ano de 2020. Diante desses fatos, muitos estudos encontram-se em andamento para a busca de candidatos a fármacos eficazes contra o ZIKV. Dentre as proteínas não estruturais, a NS5 desperta grande interesse como alvo farmacológico, devido a já existir um inibidor de NS5 domínio RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) aprovado para uso clínico contra o vírus da Hepatite C. A RdRp é responsável pela síntese de RNA de novo, ou seja, sem a necessidade de um primer para o início da síntese. Promove a elongação do RNA viral, através da polimerização fazendo o uso de NTPs, garantindo assim a replicação viral. A inibição de qualquer uma dessas funções acarretaria o impedimento da replicação viral. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi obter a proteína NS5 do ZIKV domínio RdRp a fim de determinar a sua estrutura tridimensional por cristalografia de raios X, seguida da descoberta de inibidores. Para isso, planejamos duas construções para a proteína NS5 RdRp: a RdRp_truncada e a RdRp_integral. Com a RdRp_truncada foi possível obter cristais que produziram difração de raios X, o que possibilitou a resolução da estrutura cristalográfica da NS5 domínio RdRp a 1.9 Å. Essa estrutura foi utilizada para realizar a triagem computacional de inibidores, assim como ensaios biofísicos para a busca de possíveis ligantes. Com a RdRp_integral, foi possível a padronização de um ensaio baseado no marcador fluorescente de ácido nucleico SYBR Green I, que monitora a atividade da proteína em tempo real, e que foi utilizado na busca por inibidores em larga escala. Foi possível triar a inibição de mais de 500 compostos, incluindo a biblioteca de compostos drug-like da Pandemic Response Box (Medicines for Malaria Venture - MMV) (PRB), e os compostos sintéticos e provenientes de produtos naturais que foram encontrados por triagem biofísica e virtual. Ao todo, foram identificados 17 potenciais inibidores da NS5 RdRp, sendo que 9 deles apresentaram inibição na faixa micromolar (IC50 ≤10 μM) e 5 deles apresentaram inibição na faixa nanomolar (IC50 ≤ 1 μM). Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que, apesar da ausência de estruturas cristalográficas complexadas com ligantes, foi possível encontrar moléculas com alta inibição, que podem ter sua ação otimizada por ensaios computacionais e posteriormente testadas contra a RdRp. Dentre elas, os compostos provenientes de produtos naturais que se mostraram extremamente interessantes, em especial os derivados do anel flavonol, que se mostram potentes na inibição da atividade da RdRp.