Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2023 |
| Autor(a) principal: |
Clementino, Lívia Oliveira Dantas |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Tese
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-17082023-114630/
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Resumo: |
A resistência bacteriana a antibióticos é um problema de saúde pública, com tendência a se agravar ao longo do tempo. A consequência disto é refletida na quantidade de mortes provocadas por infecções de tais microrganismos, estimada em 7.7 milhões em 2019, número com tendência a aumentar. Neste contexto, iniciou-se o estudo de quatro enzimas presentes no cluster gênico epa. As proteínas Epa sintetizam e exportam carboidratos constituintes da parede celular de Enterococcus, envolvidos também na composição de biofilmes. Realizaram-se clonagem, expressão heteróloga e purificação com as enzimas EpaI, EpaOX, EpaB e EpaE de Enterococcus faecalis DSM20478. Apesar de diferentes estratégias aplicadas para otimizar a expressão e purificação dessas proteínas, a EpaE foi a única a apresentar rendimento e estabilidade razoáveis para ser submetida a uma triagem envolvendo múltiplas condições de cristalização. Um conjunto de dados foi coletado na linha Manacá do anel síncrotron brasileiro, o Sirius. O grupo espacial do cristal é o P21, apresentando fração de twinning pseudomeroedral. A estrutura refinada da EpaE foi determinada a 2.85 Å. Ela tem conformação tetramérica na unidade assimétrica, com um enovelamento do tipo Rossman. Análises realizadas pelo servidor PDBePISA indicaram que as interfaces formadas pelas cadeias A e B, e C e D são mais estáveis do que a B e C, e A e D, sugerindo se tratar de um dímero de dímeros. O sítio catalítico da EpaE foi identificado a partir da sobreposição estrutural com outra RmlA de maior resolução. Durante o refinamento da EpaE, foi percebida a presença de uma densidade eletrônica correspondente a molécula de timidina, presente no provável sítio alostérico da EpaE. O protocolo estabelecido para medir a atividade de RmlAs foi aplicado, ele detecta fosfato em solução a partir do reagente verde de malaquita. Entretanto, foi observado que o reagente verde de malaquita não é uma boa solução colorimétrica por não possuir intensidade das curvas de absorbância proporcional à concentração de fosfato no meio. Para sanar este problema, a técnica de detecção de fosfato com azul de molibdênio foi testada na medida da atividade específica da EpaE. Por fim, o programa AlphaFold2 realizou predição das demais enzimas presentes no cluster epa, possibilitando elucidação de algumas funções dessas enzimas na síntese e transporte do antígeno polissacarídeo enterocócico de E. faecalis. Neste trabalho, determinamos a primeira estrutura cristalográfica de uma enzima do cluster epa e avançamos na identificação de um potencial inibidor da enzima EpaE. |
