Estresse oxidativo mitocondrial e deficiência familiar de glicocorticoide: caracterização fenotípica e funcional da nova variante p.G866D no gene Nicotinamide Nucleotide Transidrogenase (NNT)

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Bodoni, Aline Faccioli
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Deficiência Familiar de glicocorticoide; Estresse oxidativo; Familial Glucocorticoid Deficiency; Gene NNT; Insuficiência Adrenal; Mutação; Mutation; NNT gene; Oxidative stress
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17144/tde-23032018-131353/

Introdução: a proteína mitocondrial codificada pelo gene Nicotinamide Nucleotide Transidrogenase (NNT) regula o processo intramitocondrial de desintoxicação de espécies reativas de oxigênio (EROs). Defeitos na homeostase desse sistema (sistema Redox) podem comprometer a esteroidogênese adrenal. Objetivo: caracterizar o impacto funcional da nova variante missense NNT p.G866D (c.2597G>A) e sua associação com o fenótipo de deficiência familiar de glicocorticoide (DFG). Indivíduos e Métodos: Caso índice: lactente com DFG diagnosticada aos 18 meses, seus pais e irmão assintomáticos e controles saudáveis. O ácido desoxirribonucleico (DNA) genômico do caso índice foi submetido a sequenciamento exômico que revelou, entre algumas variantes gênicas-candidatas, a variante (c.2597G> A; p.G866D) em homozigose no exon 17 do gene NNT. Avaliou-se a segregação familiar dessa variante com o fenótipo de DFG. A análise funcional in vitro dessa variante foi realizada em cultura transitória de células mononucleares sanguíneas do paciente, heterozigotos e controles em condição basal e após a indução do estresse oxidativo com 100?m de H2O2 por cinco horas. A expressão do RNAm do gene NNT nessas células foi realizada por meio de qPCR. Os parâmetros mitocondriais avaliados foram: a produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROS) detectadas por CMDCFDA, a concentração de glutationa reduzida (GSH) e ATP celular medidos ensaios luminescentes, , além da massa e potencial de membrana mitocondrial avaliados com o probe MitoTracker. Resultados: A análise de segregação familiar confirmou a segregação desta variante em homozigose com o fenótipo de DFG. A expressão do NNT RNAm foi semelhante entre paciente, heterozigotos e controles. Em homozigose a variante p.G866D no gene NNT causa aumento na produção de EROs, diminuição de GSH e diminuição da massa e potencial de membrana mitocondrial, tanto em condições basais, quanto após a indução de estresse oxidativo. Após a indução de estresse oxidativo as concentrações de ATP foram menores no homozigoto NNT p.G866D do que nos controles. Conclusão: este estudo confirma a associação da variante NNT em homozigose com o fenótipo de DFG Tipo quatro. In vitro o mutante homozigoto NNT p.G866D reduz significativamente os mecanismos de defesas antioxidantes, comprometendo o sistema da glutationa redutase, levando ao acúmulo de EROs.