Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2014 |
| Autor(a) principal: |
Bisson Filho, Alexandre Wilson |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Tese
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-29042014-145345/
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Resumo: |
FtsZ é homóloga de tubulina, presente em quase todas as bactérias, que se autoassocia em filamentos que formam uma estrutura chamada anel Z dentro das células. O anel Z quando formado recruta de um macrocomplexo proteico chamado divisomo, que é responsável pela síntese do septo de divisão, formando duas células filhas. Diversos moduladores se ligam diretamente a FtsZ regulam sua polimerização, controlando o momento e o local onde o anel Z é formado. MciZ é um peptídeo de 40 aminoácidos expresso durante a esporulação de Bacillus subtilis e inibe a formação do do anel Z na célula mãe. O objetivo do presente trabalho foi estudar a interação entre as proteínas FtsZ e MciZ e investigar os mecanismos envolvidos na inibição da polimerização de FtsZ por MciZ. Através de uma triagem genética, usando uma biblioteca de mutantes de ftsZ, identificamos treze mutações em ftsZ que conferiram resistência à superexpressão de MciZ in vivo. Sete delas eram capazes de crescer na presença e na ausência da superexpressão de MciZ e as outras seis se mostraram dependentes da superexpressão de MciZ. A partir da coexpressão e copurificação do complexo FtsZ:MciZ, observamos que todas as proteínas mutantes ainda continuavam interagindo com MciZ in vitro. O Kd estimado para a interação entre as proteínas foi de 150±50nM, e mostrou-se que MciZ não se liga nem ao CTP (C-Terminal Peptide) de FtsZ, nem compete com GTP para a ligação no mesmo sítio. Usando construções truncadas de MciZ, determinou-se que o N-terminal da proteína (resíduos 1 ao 27) é suficiente para inibição. A partir das estruturas tridimensionais de MciZ (RMN) e do complexo FtsZ:MciZ (cristalografia de raios x), determinou-se que MciZ é um peptídeo desenovelado, que assume uma estrutura terciária ao interagir através da sua α-hélice H2 e folha-β B2 com a α-hélice H10 e a folha-β S9 de FtsZ. MciZ mostrou-se capaz de reduzir o tamanho dos protofilamentos de FtsZ de forma subestequiométrica, gerando fragmentos menores de filamentos. Proporções de MciZ:FtsZ de 1:10 foram suficientes para extinguir completamente o anel Z, confirmando a inibição subestequiométrica também in vivo. A conservação da inibição da fusão FtsZ-MciZ e a cinética de despolimerização de FtsZ induzida por MciZ provaram que MciZ não é um simples sequestrador. Marcações fluorescentes de MciZ sugeriram que o peptídeo é capaz de interagir com o anel Z in vivo, e também decorar feixes de FtsZ in vitro, formando focos localizados frequentemente na ponta dos filamentos. Cossedimentações com polímeros de FtsZ mostraram a presença de MciZ ou da fusão FtsZ-MciZ. Apesar de MciZ induzir o aumento da atividade GTPáscia específica de FtsZ, a ausência de hidrólise de GTP não eliminou o efeito subestequiométrico de MciZ. Nossos resultados em conjunto mostram que MciZ é um capeador dos filamentos de FtsZ, bloqueando a elongação pela ponta menos e bloqueando o anelamento entre protofilamentos |
