Participação da cadeia leve de dineína 2, DYNLL2, na dinâmica de montagem e desmontagem do cílio primário

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: García Iturralde, Santiago Andrés
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Cílio primário; Dinâmica do cílio primário; Dynamics of primary cilia; DYNLL2; Primary cilia
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-28012022-115436/

O cílio primário é uma organela sensorial da superfície celular, presente na maioria das células quiescentes ou diferenciadas em vertebrados. Estruturalmente semelhante aos cílios móveis e flagelos, o cílio primário é formado por um axonema central recoberto por um domínio da membrana plasmática e apoiado a um corpúsculo basal, o centríolo mãe. Defeitos nas proteínas que formam o cílio ou em sua maquinaria de montagem causam doenças denominadas ciliopatias. A dinâmica da montagem e desmontagem e a função sensorial do cílio primário requer uma atividade contínua do transporte intraciliar bidirecional, que é semelhante ao transporte intraflagelar e envolve os motores moleculares dineína citoplasmática e cinesinas. As proteínas DYNLLs são cadeias leves multifuncionais que interagem com diversas proteínas, incluindo a Miosina-Va. Recentemente nosso grupo identificou interação da Miosina-Va com a proteína centrossomal-ciliar RPGRIP1L localizadas no corpúsculo basal dos cílios primários. Sabendo da interação da DYNLL2 com Miosina-Va e desta com o cílio primário, o presente estudo teve como objetivo esclarecer o papel da DYNLL2 na dinâmica de montagem e desmontagem do cílio primário. Os objetivos específicos deste trabalho foram analisar a localização da DYNLL2 na estrutura do cílio primário e avaliar os efeitos do silenciamento e superexpressão da DYNNL2 na dinâmica e fenótipo do cílio primário. Para responder nossas hipóteses foram usadas as células do epitélio pigmentado da retina humana imortalizadas com o vetor pGRN145 hTERT (RPE-1 hTERT). Para a superexpressão, foi utilizado o vetor lentiviral FUGW-DYNLL2, e para o silenciamento, utilizamos o vetor FUG.12-shDYNLL2. Após a transdução dos vetores, as células foram separadas por sorting celular de acordo com a intensidade de fluorescência, a fim de homogeneizar a população das células. A modulação da expressão da DYNLL2 foi confirmada através do qPCR-RT e imunodetecção de proteínas (Western blot). A localização celular da DYNLL2 foi analisada através da imunocitoquímica seguida de visualização e registro por microscopia confocal. A dinâmica da montagem e desmontagem foi estudada calculando a porcentagem de células ciliadas e o comprimento ciliar. Nossos dados demonstram a localização da DYNLL2 no centrossomo e na base do cílio primário. As análises fenotípicas mostram que nem a superexpressão nem o silenciamento da DYNLL2 afetam o número de células ciliadas, mas em várias condições de cultivo, tanto a superexpressão como o silenciamento reduzem o comprimento ciliar e aumentam a porcentagem de células na fase G0/G1 do ciclo celular. Os dados do presente estudo nos levam a concluir que a proteína DYNLL2 participa na dinâmica de montagem e/ou desmontagem dos cílios primários em células epiteliais e retarda o ciclo celular.