Caracterização de alterações genômicas caóticas em osteossarcoma

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Gomes, Alexandra Galvão
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Chaotic rearrangements; Chromosomic instability; Chromothripsis; Citogenômica; Cytogenomics; Instabilidade cromossômica; Osteosarcoma; Osteossarcoma; Rearranjos caóticos
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-14052020-090705/

Metodologias de sequenciamento do genoma total para investigação de diferentes tipos de câncer detectaram recentemente uma nova classe de alterações caóticas de DNA, denominada Chromothripsis. Este fenômeno de instabilidade genômica é relativamente comum em tumores de Osteossarcoma (OS), mas existem poucos estudos que expliquem esta conexão ou abordem suas causas e consequências. A presente tese iniciou-se com a re-análise de microarrays de dez amostras de OS pediátrico, previamente processadas pelo nosso laboratório, para avaliar a variação de número de cópias de DNA (CNVs). Usando ferramentas de detecção de padrões característicos de chromotripsis (CTLPs), encontramos 3 amostras de OS com chromotripsis, que afetaram quatro cromossomos (2, 10, 14 e 20). As amostras com presença de chromotripsis tiveram uma media de 468 CNVs/amostra, enquanto o grupo sem o fenômeno teve uma média de 255 CNVs/amostra. Após essa avaliação de CNVs, comparamos os níveis de expressão de RNA entre duas amostras com a presença e quatro tumores com ausência de chromotripsis. Cerca de 171 genes estão presentes em regiões de CNVs diferentes entre os grupos avaliados. Destes, a maioria (77 genes) são relacionados com funções de comunicação celular e ao ciclo celular. Um grupo de 43 genes foi relacionado às vias de processo metabólico (principalmente associado ao metabolismo do RNA) e 27 genes associados à organização do componente celular ou biogênese. Tumores com Chromothripsis possuiam 4 genes do sistema imune menos expressos (CADM1; CLEC4A; CCR1; CD164) e 12 estavam superexpressos (IL32, LAT, BCL3, FCAR, RFX1, ILIB, CXCL1, SPON2, CCR6, IL6, SEMA3C, GEM). Os genes pouco expressos também têm um papel na via de adesão celular. A adesão celular está associada à progressão do câncer e metástase. Em seguida, re-analisamos as CNVs de 82 amostras de OS e 35 linhagens celulares de OS, usando microarrays disponíveis em bancos de dados públicos (GEO e arrayexpress), para identificar potenciais regiões cromossômicas comumente envolvidas em alterações caóticas no número de cópias de DNA, especialmente CTLPs. Identificamos Chromothripsis em 27 amostras (11 tumores e 16 linhagens), afetando 17 cromossomos diferentes. Os cromossomos 2, 8 e 12 foram alvos frequentes de chromotripsis em OS. Em seguida, foram analisados dados de sequenciamento WGS de 12 tumores de OS disponíveis no banco de dados online dbGaP. Fizemos a avaliação da variação de número de cópias para caracterizar detalhadamente as alterações caóticas e identificar as regiões cromossômicas alvo envolvidas nas regiões de alterações caóticas no número de cópias do DNA. Encontramos CTPLs em 7 (58%) das 12 amostras de OS analisadas, usando dados de sequenciamento total. Foram encontrados 12 cromossomos diferentes afetados pelo fenômeno de alteração caótica. CTPLs foram detectadas em 62,5% das amostras de pacientes que faleceram em decorrência deste tumor. Os cromossomos 1, 3 e 7 foram um pouco mais afetados por Chromothripsis nas amostras disponibilizadas pelo dbGaP. Além disso, os cromossomos 2 e 12 também foram afetados por chromotripsis nessas amostras. Cerca de 700 genes/tumor foram encontrados nas regiões de CTLPs. Um total de 101 genes foram localizados em regiões de alteração de número de cópias que distinguem os grupos com e sem chromotripsis. Estes genes estão relacionados com vias de processo celular (45 genes - os quais 17 estão associados à comunicação celular) e processo metabólico (22 genes - os quais 19 estão associados ao processo metabólico primário). Nós também comparamos os níveis de expressão gênica das amostras disponíbilizadas pelo dbGap, em que foram avaliados dados de expressão de 6 amostras de RNA de OS com chromotripsis e de 3 amostras de RNA de OS sem chromotripsis. Diferentes algoritmos e ferramentas foram utilizadas para avaliação de RNA. Nós analisamos os dados de expressão por dois diferentes mecanismos: EdgeR e Nexus Expression. Ambos mostraram menor expressão de RNA nas vias de comunicação celular e processo metabólico primário em amostras com chromotripsis. Os genes com regulação negativa da resposta do sistema imunológico foram encontrados em ambas ferramentas (COL8A1, CCL25). Para estudar os cromossomos envolvidos na formação de micronúcleos na linhagem celular U2OS, foram investigados erros na divisão celular induzidos por drogas (durante a anáfase). Esta etapa foi realizada durante o período de doutorado sanduíche, no Barts Cancer Institute, em Londres-UK. Os cromossomos com erros durante a anáfase foram contados por meio da técnica de FISH centromérica. Os cromossomos mais comumente encontrados com erros foram Chr2, Chr6, Chr11 e Chr12. Estes dados corroboram a ideia de que alguns cromossomos são mais suscetíveis a erros de divisão celular e colaboram para maiores índices de CTPLs em certos tumores. O fenômeno chromotripsis parece estar presente em pelo menos 30% dos tumores de osteossarcoma e pode estar contribuindo para o fenótipo mais agressivo deste tumor ósseo.