Descoberta de candidatos antivirais baseados na enzima NS5 RNA polimerase RNA-dependente do vírus da febre amarela

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Oliveira, Victor Gawriljuk Ferraro
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Antivirais; Antivirals; Descoberta de fármacos; Drug discovery; Febre amarela; NS5; Yellow fever
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-03092021-113747/

O ressurgimento da febre amarela em regiões não-endêmicas do Brasil e do continente africano entre 2016 a 2018, colocou em risco regiões urbanas com alta densidade populacional e baixa cobertura vacinal. A ausência de um tratamento para a febre amarela, assim como a necessidade de fármacos para o controle de vírus emergentes, reforça a importância na busca por novos antivirais. O objetivo deste trabalho foi a busca de candidatos antivirais a partir da enzima NS5 RNA polimerase RNA-dependente (RdRp) do vírus da febre amarela. Para este propósito, a produção da forma recombinante dessa enzima, assim como, dois ensaios de elongação de uma fita de RNA foram padronizados. O primeiro consistiu no uso de nucleotídeos modificados e uma reação acoplada à fosfatase alcalina, enquanto no segundo, a atividade da proteína foi medida pela sonda intercalante SYBR Green I (SGI). O ensaio com a sonda SGI apresentou maiores intensidades de fluorescência e maior facilidade na implementação em experimentos de média escala, logo, ele foi escolhido para a busca e caracterização de inibidores. Em seguida, realizou-se a triagem da biblioteca de compostos MMV/DNDi Pandemic Response Box e foram identificadas 25 moléculas como inibidores da RdRp. Diversos compostos apresentaram potência inibitória na faixa de nanomolar, indicando a possível presença de falsos-positivos na triagem. As moléculas foram validadas por ensaios de interferência ao SGI e 18 compostos interferiram de maneira significativa com a sonda. Dentre os inibidores considerados confiáveis pelo contra-ensaio, a Clofazimina, TTP-8307 e MMV218827 apresentaram potência inibitória na faixa de 0.2 a 4 micromolar. Apesar da alta potência demonstrada pelo MMV218827 (IC50 = 0.2 μM), ele foi desconsiderado como um candidato promissor após desestabilizar a RdRp em ensaios de fluorimetria de varredura diferencial e, também, por pertencer a uma classe de moléculas que causam inibição inespecíficas em proteínas. A Clofazimina (IC50 = 4 μM) e TTP-8307 (IC50 = 4 μM) aumentaram a estabilidade da proteína e apresentaram estruturas químicas inéditas para inibidores de RdRp, expandindo o desenvolvimento de novas moléculas para esse alvo. Ensaios de cristalização também foram realizados, no entanto, não foi possível obter cristais da proteína. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que o ensaio de elongação com a sonda SGI pode ser utilizado para triagens de inibidores da RdRp do vírus da febre amarela, com a Clofazimina e o TTP- 8307 sendo estes possíveis candidatos a antivirais para esse vírus, contudo, serão necessários estudos futuros para a avaliação de suas atividades em células.