Efeito de LonA nos processos de síntese e mobilização de poli-3-hidroxibutirato.

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Sakalauskas, Gabriela Cazonato Lozano
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Ralstonia eutropha; Escherichia coli recombinant strain; Escherichia coli recombinantes; LonA protein; P3HB synthesis and mobilization; Poli-3-hidroxibutirato; Poly-3-hydroxybutyrate; Protein purification; Proteína LonA; Purificação de proteínas; Síntese e mobilização de P3HB
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-08122021-122537/

Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres armazenados intracelularmente em diversas bactérias. Estes são sintetizados principalmente em condições de excesso de fonte de carbono e limitação de nutrientes essenciais, e degradados pela mobilização dos grânulos quando há escassez de carbono e/ou energia. O PHA mais conhecido é o poli-3-hidroxibutirato (P3HB). Sabe-se que a síntese de PHA depende principalmente das PHA sintases (PhaC), enquanto a mobilização ocorre pela ação das PHA despolimerases intracelulares (sendo PhaZa1 a de maior destaque). Um estudo anterior com linhagens recombinantes de Escherichia coli capazes de acumular P3HB demonstrou que a expressão simultânea dos genes lonA e phaZa1, de Ralstonia eutropha, resulta em altas taxas de mobilização do polímero previamente acumulado. Porém, não se observa mobilização expressiva quando um ou outro gene encontra-se isolado na célula. Surpreendentemente, a presença de LonA isoladamente na cepa recombinante de E. coli leva a um aumento significativo no acúmulo de P3HB intracelular, sugerindo que LonA desempenhe papel também na síntese do polímero. O presente trabalho avaliou o teor de P3HB em diferentes linhagens de E. coli (XL1-Blue, LS5218 e MG1655), capazes de acumular este polímero por meio de dois diferentes plasmídeos (pSK-::phaCAB e pJM9131), com e sem a presença do gene lonA, clonado no vetor pBBR1MCS-5. Nos cultivos realizados em agitador rotativo, todas as cepas analisadas apresentaram significante aumento das taxas de P3HB acumulados quando há expressão de lonA. A cepa recombinante de E. coli XL1-Blue abrigando o plasmídeo pJM9131 se mostrou mais eficiente no acúmulo do biopolímero quando lonA era expresso, atingindo mais de 65% da MSC, sendo esta cepa eleita para cultivos em biorreator. Os resultados dos cultivos em biorreatores indicam que a presença de LonA leve a uma alteração geral no metabolismo celular, favorecendo não apenas o acúmulo de P3HB, mas também o crescimento celular. Deste modo, LonA parece ter um efeito pleotrópico neste processo. Paralelamente a este trabalho, foram construídas linhagens de E. coli capazes de acumular P3HB, abrigando o gene phaP1, que codifica a PHAsina mais abundante na célula, e outra combinando os genes phaP1 e phaZa1. PHAsinas são proteínas que estão associadas à superfície dos grânulos de PHA, conferindo maior estabilidade aos mesmos. Alguns autores demonstram que a coexpressão de PHAsinas e PHA despolimerases intracelulares influencia na capacidade da célula de degradar o polímero intracelular. Desta forma, este trabalho buscou comparar o efeito de LonA e de PhaP1 no processo de mobilização de P3HB, através de cultivos in vivo e da tiólise dos grânulos in vitro. Os dados apresentados mostram que, embora ambas as proteínas avaliadas sejam importantes ativadores da mobilização em linhagens de E. coli, o efeito decorrente da presença de LonA é mais expressivo, sugerindo que essa enzima seja essencial para que a degradação ocorra. Os ensaios in vitro apontam ainda que LonA não seja uma proteína associada ao grânulo. Foi realizada a expressão e purificação das proteínas recombinantes LonA, PhaC e PhaZa1, individuais ou combinadas (LonA+PhaC e LonA+PhaZa1), em fusão com um peptídeo composto por múltiplos resíduos de histidina. Entretanto, não foi possível demonstrar uma interação direta pela copurificação de LonA com PhaC ou com PhaZa1. Todos os genes clonados neste trabalho foram obtidos a partir do genoma de R. eutropha.