Caracterização funcional da interação entre a E3 ubiquitina ligase SCF(Fbxo7) e as proteínas UXT-V1 e UXT-V2

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Spagnol, Valentine
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: E3 ubiquitin ligases; E3 ubiquitina ligases; Fbxo7; Ubiquitinação; Ubiquitination; UXT
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-21062022-143841/

Fbxo7 é uma das 69 proteínas do tipo F-box em humanos que interage com SKP1, Culina1 e RBX1 para formar o complexo enzimático E3 ubiquitina ligase SCF(Fbxo7), que promove a ubiquitinação de seus substratos. A proteína Fbxo7 é superexpressa em uma variedade de linhagens celulares tumorais humanas, mas não nesses tecidos normais, e é descrita como um regulador negativo da via de sinalização de NF-κB por mediar a ubiquitinação de cIAP-1 e TRAF2. Em um estudo de identificação de substratos em larga escala, foi identificada a proteína UXT (Ubiquitously Expressed Transcript) como um potencial substrato de SCF(Fbxo7). Esta proteína pertence à família das prefoldinas (PFD) e é amplamente expressa em diversos tecidos humanos. Duas isoformas de UXT, UXT-V1 e UXT-V2, foram descritas com funções distintas, sendo a UXT-V2 um cofator transcricional que ativa a transcrição de NF-κB no núcleo e a UXT-V1 modulando a apoptose induzida por TNF no citoplasma. Combinamos as técnicas de co-imunoprecipitação, ubiquitinação in vitro e em células, análise de restrição de cadeia de ubiquitina, ensaio de estabilidade com cicloheximida, fracionamento celular e microscopia confocal para investigar a interação entre Fbxo7 e ambas as isoformas de UXT. Validamos a UXT-V1 e a UXT-V2 como substratos da E3 ubiquitina ligase SCF(Fbxo7) e mostramos que SCF(Fbxo7) realiza uma modificação pós-traducional para regulação de função na UXT-V1 e para degradação do substrato via proteassoma na UXT-V2. Demostramos que a superexpressão de UXT-V2, mas não de UXT-V1, recruta Fbxo7 do citosol para o núcleo das células para mediar a interação entre elas e observamos que as isoformas diferem em suas localizações subcelulares. Também mostramos que o knockdown de FBXO7 ou a superexpressão do mutante Fbxo7-ΔF-box protege a UXT-V2 da degradação proteassomal mediada por Fbxo7, aumentando a resposta dos repórteres da via do NF-κB. Neste trabalho, demonstramos que SCF(Fbxo7) promove a degradação proteassomal da UXT-V2, tendo por consequência funcional a inibição da via de sinalização do NF-κB e caracterizando um novo ponto de regulação da via. Por fim, resultados preliminares demonstraram que a UXT-V2 promove um aumento na ubiquitinação do Estrogen Receptor (ER) e, ao contrário, promove uma redução na ubiquitinação do Androgen Receptor (AR). A caracterização da interação entre Fbxo7/UXT com os receptores AR e ER será avaliada em ensaios posteriores.