Caracterização de uma cálcio ATPase PMR1 de \'Aspergillus fumigatus\'

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Soriani, Frederico Marianetti
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: 1. Aspergillus fumigatus; 2. cálcio ATPase; 2. calcium ATPase; 3. PMR1; 4. RNAi.
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-02102008-163023/

Os conhecimentos sobre a regulação dos níveis de cálcio e manganês no Aspergillus fumigatus são bastante limitados, sendo que a homeostase destes íons pode ser diretamente controlada pela ação de ATPases específicas, dentre elas as cálcio ATPases da subfamília PMR1. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi a expressão, caracterização e validação como alvo quimioterapêutico do gene Afpmr1 de A. fumigatus. Inicialmente, foi realizada a complementação funcional, de uma cepa de S. cerevisiae nocaute para a PMR1, em meios de cultura suplementados com EGTA ou manganês, revertendo o fenótipo da cepa nocute. Além disto, após expressão do gene Afpmr1, foi verificada uma reversão na intensa distribuição de quitina na parede celular da cepa nocaute. Paralelamente, para a RNAi, um fragmento do gene Afpmr1 apresentando baixa identidade com outros genes de cálcio ATPases de diferentes espécies foi clonado em vetor de expressão em A. fumigatus (pALB1). Após indução da expressão, a construção de RNA dupla fita para RNAi silenciou tanto o gene alb1 isoladamente (clone controle), quanto o duplo silenciamento com o gene de interesse Afpmr1, conferindo à ambas construções coloração branca às colônias. Uma vez confirmado o silenciamento gênico, por técnicas de RT-PCR quantitativo, os clones selecionados foram utilizados em ensaios de fagocitose e killing de macrófagos. O clone com o gene Afpmr1 silenciado apresentou diminuição na porcentagem de fagocitose, no número médio de conídios fagocitados e na eficiência de eliminação destes conídios quando comparados com seus controles. Estes resultados mostram que o gene Afpmr1 pode ser expresso funcionalmente em sistemas heterólogos e seu silenciamento, em A. fumigatus, influencia processos celulares que podem estar relacionados à manutenção da estrutura e composição da parede celular, além de desencadear alterações na fagocitose e killing de macrófagos.