Expressão homóloga de acetilxilano esterase de Aspergillus nidulans: purificação, imobilização e propriedades funcionais

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Alves, Gabriela Souza
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Acetilxilano esterase; Acetylxylan esterase; Expressão homóloga; Homologous expression; Immobilization; Imobilização; Magnetic iron nanoparticle; Nanopartícula de ferro magnética; Sinergismo; Synergism; Xilooligossacarídeos; Xylooligosaccharides
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17131/tde-05022024-152804/

As acetilxilano esterases (EC 3.1.1.72) são enzimas acessórias que catalisam ligações ésteres dos grupos acetil presentes na estrutura do xilano acetilado e são classificadas na família dos carboidratos esterases (CEs). O presente trabalho teve como objetivo geral a expressão homóloga, produção, purificação, propriedades funcionais e imobilização da acetilxilano esterase de Aspergillus nidulans (AxeAN). Inicialmente, o vetor pEXPYR foi utilizado para codificar o gene da acetilxilano esterase de A. nidulans (AxeAN), seguido da transformação em A. nidulans A773. Esse sistema de expressão permite a secreção de alta produção de proteínas. Na primeira parte deste trabalho, foi produzido a AxeAN recombinante, o extrato foi concentrado e purificado em uma coluna de troca aniônica (Hiprep Q FF 16/10), seguida por uma coluna de exclusão por tamanho (Superdex 75 10/300 GL). AAxeAN purificada foi evidenciada por SDS-PAGE, no qual foi observada a massa molecular de 33,5 kDa. A análise de sequência, modelagem molecular da AxeAN e a análise filogenética revelaram a presença da tríade catalítica (Ser128, His270 e Asp213) e a presença de 10 folhas β e 10 α-hélices, perfil característico de proteínas pertencentes à família α/β hidrolase. O dicroísmo circular confirmou as análises anteriores, demonstrando que a estrutura da AxeAN é composta por α-hélices e folhas β. A AxeAN purificada apresentou atividade específica de 170 U mg-1 determinada para o substrato p-nitrofenil acetato (pNPA). O efeito do pH e da temperatura foi avaliado, e a enzima demonstrou atividade máxima em pH 7,0 e a 55 ºC. A AxeAN apresentou estabilidade em uma ampla faixa de pH (5,5-9,0), mantendo em média 80% de sua atividade inicial após 24 horas de incubação. Além disso, a termoestabilidade foi observada a 45 e 50 ºC por 18 horas de incubação, mantendo uma atividade residual acima de 70%. O efeito de íons, EDTA e possíveis inibidores (furfural e 5-hidroximetil furfural) também foi analisado. A AxeAN apresentou 100% de atividade relativa na presença de Mn2+, Na+ e K+ em concentrações de 1 mmol. L-1 e 5 mmol. L-1. Não foi observado efeito negativo com o uso de EDTA em sua atividade. Por outro lado, houve um aumento na atividade com furfural e 5-hidroximetil furfural. Os parâmetros cinéticos foram determinados utilizando pNPA como substrato, os valores de KM e Vmáx foram de 0,098 mM e 320,1 U. mg-1, respectivamente. O efeito sinérgico da AxeAN foi avaliado juntamente com uma endo-1,4-βxilanase (MpXyn10) de Malbranchea pulchella, utilizando quatro diferentes xilanos (Birchwood, Beechwood, Oat spelt e Arabinoxilano). Os maiores valores foram observados com xilano Birchwood, em especial na produção de xilobiose (13,44 mg. mL-1) com MpXyn10-AxeAN em comparação com apenas MpXyn10, que apresentou uma produção de 10,93 mg. mL-1 após 24 horas a 50 ºC. Na segunda parte deste trabalho, para a imobilização enzimática foi preparado suportes à base de agarose (Amino-agarose, Glioxil-agarose e IDA-agarose), assim como a síntese de suportes à base de nanopartículas de ferro magnética (NPM) (GA-APTES-Nano e APTES-Nano). Também foram utilizados os suportes comerciais NPM (GA-APTES-Nano(TM) e APTES-Nano(TM) juntamente com o Purolite(TM) um suporte comercial, resultando em um total de oito suportes funcionalizados para a imobilização da AxeAN. Os processos de imobilização foram avaliados, e seis derivados (Amino-agarose, Purolite(TM), GA-APTES-Nano, APTES-Nano, GA-APTES-Nano(TM) e APTES-Nano(TM) foram selecionados para as próximas etapas. Os derivados APTES-Nano e APTES-Nano(TM) apresentaram as melhores termoestabilidade a 60 ºC por até 30 minutos, com 90% de atividade residual, em comparação com a enzima livre, que no mesmo período, apresentou apenas 30% de sua atividade residual. Por fim, o derivado GA-APTES-Nano demonstrou a melhor estabilidade operacional, mantendo 95% de atividade após seis ciclos de reação. Os resultados deste estudo mostram-se promissores para a aplicação da AxeAN em futuras hidrólises de biomassa lignocelulósica, visando a obtenção de xilooligossacarídeos e a aplicação em biorrefinarias.