Determinação da porcentagem de espermatozóides portadores de cromossomos X e Y no sêmen sexado mediante PCR em tempo real

• Ano de defesa: 2011
• Autor(a) principal: Sverzut, Viviane Guidi
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Citometria de fluxo; Flow cytometer; Gene PLP; Gene SRY; PCR em tempo real; PLP gene; Real time PCR; Sêmen sexado; Sexed semen; SRY gene
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/74/74131/tde-18112011-100013/

A produção animal atualmente conta com diferentes biotecnologias para aumentar sua produtividade, incluindo técnicas aplicadas na reprodução. A inseminação artificial, por exemplo, vem sendo aplicada há muitos anos e de maneira extensiva. Esta tem como objetivo o aproveitamento de apenas um ejaculado em diversas prenhezes viabilizando a realização de testes de progênies e um grande aproveitamento de touros melhoradores. Atualmente essa técnica pode contar com um material ainda mais específico, o sêmen sexado que possui maior porcentagem (acima de 87%) de espermatozóides portadores de cromossomo X ou Y resultando numa progênie com o sexo predeterminado. A pré-seleção do sexo vem sendo estudada desde final dos anos 70, uma das linhas de pesquisa resultaram no desenvolvimento de um equipamento, o citômetro de fluxo, em que a célula espermática tem seu conteúdo de DNA estimado e, na seqüência é orientado para separação. Atualmente essa técnica é utilizada para produção de sêmen sexado comercialmente, anteriormente à comercialização do produto, a confirmação da taxa de separação dos cromossomos X e Y é realizada pelo próprio equipamento, o que acrescenta um custo operacional e pode introduzir um viés na confirmação da taxa de sexagem. Sendo assim o objetivo desse trabalho foi elaborar um protocolo de confirmação da taxa de sexagem mediante PCR em tempo real, utilizando sonda TaqMan® em regiões dos genes X-específico (PLP) e Y-específico (SRY). Foram analisadas duas sub-espécies de bovinos (Bos primigenius taurus e Bos primigenius indicus), sendo 21 doses de sêmen sexado X, 21 doses de sêmen sexado Y e 42 doses de sêmen não sexado (controle). A extração do DNA foi desenvolvida com a utilização de di-etiltreitol (DTT) e isotiocianato de guanidina. As amostras foram, em seguida, submetidas à técnica de PCR em tempo real aplicando sondas específicas. Foi possível amplificar os fragmentos específicos dos cromossomos X e Y separadamente e em conjunto e estimar a proporção relativa entre ambos. Todavia a repetibilidade do teste e sua acurácia não permitem recomendá-lo da maneira que se encontra para a aplicação na prática.