Caracterização parcial das reações de fotooxidação e eletrooxidação do dipiridamol e das subunidades de hemoglobina extracelular

• Ano de defesa: 2008
• Autor(a) principal: Oliveira, Marilene Silva
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: antioxidant; antioxidante; dipiridamol; dipyridamole; eletrooxidação; eletrooxidation; espectrometria de massas; fotooxidação; fotooxidation; HPLC; mass spectrometry; molecular oxygen singlete; oxigênio molecular singlete
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75132/tde-20062008-151251/

O dipiridamol (DIP), 2,6-bis(dietanolamina)-4,8-dipiperidinapirimida-[5,4-d] pirimidina), é conhecido por seu efeito vasodilatador coronariano e antiagregante plaquetário, exibindo também um potente efeito antioxidante fortemente inibidor da peroxidação lipídica. Além disso, tem efeito importante na proteção das células contra radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo oxigênio molecular singlete O2(1Δg). Tem sido sugerido que DIP é um eficiente antioxidante comparável à vitamina E. No presente trabalho, a supressão de O2(1Δg), pelo DIP e derivados foi analisada em acetonitrila (ACN) e em meio aquoso ácido. A excitação do azul de metileno (AM) através da técnica de laser flash fotólise foi feita em 532 nm e a emissão de luz monomolecular do O2(1Δg) foi monitorada em 1270 nm. As constantes bimoleculares de supressão obtidas em ACN são consistentes com uma eficiente supressão física, apresentando valores próximos do limite difusional (kt = 3,4-6,8x108 M-1s-1). O processo de supressão ocorre via o mecanismo reversível de transferência de cargas com a formação do exciplex. Cálculos de ΔGet associado à supressão de O2(1Δg) corroboram com uma transferência de elétrons incompleta. Em soluções aquosas ácidas (pH=3,0) os valores de kt obtidos para o DIP e derivados são 20 vezes maiores quando comparados com os valores em ACN. Os dados de supressão de O2(1Δg) são consistentes com os dados eletroquímicos. As propriedades eletroquímicas do DIP em ACN são caracterizadas por dois processos consecutivos de um elétron cada, com potenciais de meia onda de 0.30V e 0.67V vs SCE. No entanto, em meio aquoso ácido uma única onda de oxidação é observada envolvendo um processo com à perda de dois elétrons (0.80 V vs SCE). A eletrooxidação do DIP leva a formação de produtos não-fluorescentes e uma considerável mudança no espectro de absorção. Os produtos da eletrooxidação foram parcialmente caracterizados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a espectrometria de Massas (HPLC/MS). Os espectros de massas dos produtos da eletrooxidação apresentaram picos com m/z de 472, 269 e 519. O mecanismo responsável pelo efeito antioxidante de muitos compostos é geralmente estudado por laser flash fotólise (LFP), EPR, eletroquímica e experimentos de fotoquímica. A fotoquímica do DIP não é conhecida em detalhes. Neste trabalho, a fotólise do DIP em ACN e meio aquoso ácido em pH=3.0 foi estudada. Em meio aquoso ácido DIP foi oxidado pela fotosensibilização com AM e pela reação com uma fonte química de O2(1Δg), N,N\'-di(2,3-dihidroxipropil)-1,4 naftalenodipropanamida (DHPNO2). A fotooxidação ocorre predominantemente pelo mecansimo do tipo II, onde o DIP é oxidado pelo O2(1Δg), mas alguns produtos com baixa intensidade e m/z de 472 foram observados em meio ácido, o que está de acordo com a eletrooxidação. Por outro lado, em ACN, DIP é fotodegradado pelo mecansimo do tipo I, via geração de radicais ou por espécies excitadas no estado triplete, como observado através de EPR. Contudo, a oxidação produz a mesma espécie nos dois solventes. O produto obtido na reação de fotooxidação foi analisado por HPLC/MS. O dioxetano é formado como um intermediário da reação de fotooxidação. O produto formado com m/z de 269 corresponde a metade da molécula do DIP ligado a um átomo de oxigênio. A conclusão é que o DIP é fotooxidado envolvendo O2(1Δg) em soluções aquosas ou oxigênio molecular em ACN. A caracterização completa dos fotoprodutos ajudará a entender melhor a química e as propriedades antioxidantes deste composto. Outro trabalho envolvendo a hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus (HbGp) foi desenvolvido. Análises de MALDI-TOF-MS foram realizadas para obter informações sobre a massa molecular das diferentes subunidades da HbGp na forma oxi. Os experimentos foram realizados para a proteína na forma íntegra em pH 7,0, para a proteína parcialmente dissociada em pH 9.0, e para o monômero d na forma pura. Além disso, experimentos foram realizados para a proteína íntegra tratada com 2-mercaptoetanol para monitorar o efeito da redução das ligações disulfetos, responsáveis em manter a estabilidade do trímero (abc) na molécula nativa. Os resultados são comparados com a hemoglobina homóloga de Lumbricus terrestris (HbLt) e algumas tentativas de atribuição de massas são feitas para algumas subunidades. Para o monômero d duas isoformas majoritárias de idênticas proporções com massas de 16,355+-25 e 16,428+-24 Da foram observadas. A redução das pontes disulfeto produz a dissociação do trímero e novos picos correspondentes aos monômeros a, b e c são observados, apresentando massas moleculares de 18,258+-30 Da, 16,492+-24 Da e 17,363+-17 Da, respectivamente. Duas cadeias linkers para HbGp foram também observadas em 25,817+-50 e 26,761+-16 Da. Finalmente, os trímeros (abc) foram observados em 51-52 kDa. Esta caracterização parcial representa um passo importante na caracterização das subunidades desta hemoglobina gigante. O efeito dos surfactantes aniônico dodecilsulfato de sódio (SDS) e catiônico cloreto de cetiltrimetilamonio (CTAC) na estrutura oligomérica de HbGp foi estudado por MALDI-TOF-MS. Uma efetiva interação do surfactante catiônico CTAC com as duas isoformas de monômero d, d1 e d2, na proteína íntegra bem como no monômero puro d foi observada. Até 10 moléculas de CTAC são ligadas a cada isoforma do monômero. Diferentemente, o espectro de massas obtido para o sistema SDS-HbGp mostrou que a interação SDS-HbGp é significativamente menos efetiva quando comparada ao sistema CTAC-HbGp.