Estudos físico-químicos e bioquímicos de uma proteína de 21 kDa do Trypanosoma cruzi

• Ano de defesa: 2012
• Autor(a) principal: Moreira, Heline Hellen Teixeira
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Trypanosoma cruzi P21; Circular dichroism; Dicroísmo circular; Espalhamento dinâmico de luz; Homology modeling Dynamic light scattering; Inibidor de serinoprotease; Modelagem molecular por homologia; Serineprotease inhibitor
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-03052012-173820/

A proteína P21 do Trypanosoma cruzi participa no processo de infecção da célula hospedeira, desse modo é de grande importância: elucidar as vias de sinalização induzidas pela proteína, bem como caracterizar a nível molecular e estrutural a P21. O que vai auxiliar no entendimento da função biológica da P21 e sua participação no processo de infecção. A P21 recombinante é expressa Escherichia coli em sua maioria na fração insolúvel. Visando aumento de proteína na fração solúvel, foi realizada a clonagem do gene da P21 em vetor pSMT3, bem como testes de expressão subsequentes em diferentes cepas de expressão de E. coli, em vetor pET-28 e pSMT3 e variadas condições de expressão e lise celular. Desse modo obtiveram-se as condições que permitissem uma maior concentração da P21 na fração solúvel. A expressão foi realizada no vetor pET-28, cepa BL21, a 37°C com meio 2xYT a 0.5 mM de IPTG, utilizando a técnica de sonicação como lise. A P21 foi purificada em cromatografia de afinidade e posteriormente em coluna de exclusão molecular. Foram realizados estudos de modelagem por homologia levaram a elaborar a hipótese de que a P21 tem a função de inibidor de serinoprotease do tipo kunitz. Posteriormente essa hipótese foi confirmada com ensaios de avaliação da atividade inibitória da P21 frente à tripsina, quimiotripsina e elastase neutrofílica, o qual a P21 mostrou capaz de inibir a elastase neutrofílica. Estudos com espalhamento dinâmico da luz (DLS) revelaram que as amostras testadas de P21 contém diferentes concentrações de agregados de alto peso molecular em todos os pHs avaliados. Outras medidas foram realizadas para avaliar o estado de agregação da P21 de acordo com a temperatura e verificou-se que entre 32-52 °C, a proteína apresenta menor raio hidrodinâmico, indicando menor agregação nesse intervalo. Estudos de dicroísmo circular revelaram que a P21 apresenta por volta de 20% de α hélice, 32% de folha-β, 22% de volta e 23 % estrutura randômica. De acordo com a curva de desnaturação referente ao espectro de CD obtido, a P21 se mostra desnaturada a partir de 64°C.