Oxidação de resíduos de triptofano em proteínas: formação de ligação cruzada ditriptofano e implicações patofisiológicas

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Paviani, Veronica
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Beta crystalline; Carbonate radical; Cataract; Catarata; Cristalino humano; Ditriptofano; Ditryptophan; Human lenses; Lisozima; Luz UV; Lysozyme; Radical carbonato; UV light
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22082016-081739/

Apesar de extensa investigação das modificações oxidativas irreversíveis sofridas pelas proteínas in vitro e in vivo, os produtos formados pela oxidação de resíduos de triptofano ainda permanecem apenas parcialmente conhecidos. Recentemente, nosso grupo caracterizou uma ligação cruzada de ditriptofano produzida pela recombinação de radicais hSOD1-triptofanila gerados pelo ataque do radical carbonato produzido durante a atividade peroxidásica da enzima superóxido dismutase humana (hSOD1). Neste trabalho, examinamos se a ligação ditriptofano pode ser formada em outras proteínas, além da hSOD1 e por outros oxidantes, além do radical carbonato. A lisozima da clara do ovo e a beta cristalino bovina foram utilizadas como alvos de oxidação. A lisozima foi utilizada por ser uma enzima pequena (129 aminoácidos) e de estrutura bem conhecida, contendo seis resíduos de Trp. Os resultados mostraram que o radical carbonato, gerado enzimatica ou fotoliticamente, promove a oxidação, dimerização e inativação da lisozima. Os principais produtos de oxidação caracterizados por análise de nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram hidroxi-triptofano e N-formilquinurenina juntamente com um dímero de lisozima (lisozima-Trp28-Trp28-lisozima) e um hetero dímero lisozima-hSOD1 (lisozima-Trp28-Trp32-hSOD1), ambos ligados por uma ligação ditriptofano. Também demonstramos que a irradiação da lisozima com luz UVC leva à formação do dímero lisozima-Trp28-Trp28-lisozima. Em consequência, resolvemos tratar a beta cristalino bovina com radical carbonato gerado fotoliticamente ou com luz UVC, e a proteína também sofreu oxidação, dimerização e agregação. Os principais produtos de oxidação caracterizados por nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram hidroxi-triptofano, N-formilquinurenina, DOPA e um dímero de beta cristalino (βB2-Trp151-Trp151-βB2). A irradiação com luz UVC também levou à formação de um dímero intra-cadeia, caracterizado como βA2-Trp78-Trp81. Quando a beta cristalino foi irradiada com um simulador de luz solar (UVA e UVB) também foi possível observar um dímero, caracterizado como βA2-Trp150-Trp150-βA2. A presença de produtos de oxidação de resíduos de Trp, dentre eles a ligação cruzada ditritpofano, também foi avaliada in vivo, utilizando o cristalino de pacientes que foram submetidos a cirurgia para remoção de catarata. Beta, alfa e gama cristalino foram as principais proteínas identificadas nas frações solúvel e insolúvel do cristalino. A principal modificação pós-traducionais identificada foi deamidação. Um alto conteúdo de resíduos de metionina e triptofano oxidados foram identificados nas proteínas presentes na fração insolúvel. Os principais produtos de oxidação de Trp identificados por nano-ESI-Q-TOF-MS/MS foram quinurenina e N-formilquinurenina. A presença de dímeros covalentes no cristalino com catarata foi confirmada por análises de massas. A completa caracterização desses dímeros (βB1-Trp127-Trp127-βB1 e βB1-Trp193-Trp193-βB1) confirmou que as cadeias polipeptídicas foram ligadas por uma ligação ditriptofano. Em síntese, nossos dados demonstraram que o radical carbonato e a luz UV podem produzir dímeros de ditriptofano em diferentes proteínas. Também, a presença da ligação cruzada de ditriptofano in vivo (catarata humana) foi pela primeira vez detectada.