Regulação pós-transcricional em Halobacterium salinarum NRC-1: caracterização do gene VNG_RS05855

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Gutierrez, Junier Marrero
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: asRNA; Atividade in vitro; bioinformática; Bioinformatics; Ensaios fenotípicos; Halobacterium salinarum NRC-1; In vitro assays; Metallo-β-lactamases; Metalo-β-lactamases; Phenotypic assays; Post-transcriptional regulation; Regulação pós-transcricional; RNA-seq; RNases; VNG_RS05855
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/95/95131/tde-03122019-115209/

A família das enzimas metalo-β-lactamases compreende um grupo de proteínas com participação no metabolismo dos ácidos nucleicos. Nos genomas procariotos, muitas proteínas estão anotadas como potenciais metalo-β-lactamases, porém sem função comprovada. Este é o caso do gene VNG_RS05855 de Halobacterium salinarum NRC-1, organismo em que os principais atores da regulação pós-transcricional, as RNases, também são pouco conhecidos. Nesta pesquisa, relatamos a primeira caracterização da metalo-β-lactamase VNG_RS05855 da arquéia halofílica H. salinarum NRC-1 no contexto da regulação pós-transcricional, mediante a integração de abordagens experimentais e computacionais. VNG_RS05855 compartilha similaridade de sequência com proteínas descritas com atividade ribonucleolítica, porém a ausência de domínios específicos (exosite) coloca em dúvida a afirmação desta função. O gene apresenta uma expressão relativa basal durante o crescimento, que se altera diante de perturbações ambientais e genéticas, e é correlacionada a outras RNases como ocorre com RNase de outros organismos. Embora a ausência do gene VNG_RS05855 não tenha afetado nem a viabilidade nem o crescimento da linhagem nocaute (VNG_RS05855), foram observadas ligeiras diferenças fenotípicas em relação a linhagem controle frente a baixas concentrações de metais de transição (Zn2+ , Cu2+ , Fe2+ , Mn 2+ , Co 2+ ), ao metalóide NaAsO2 , ao agente oxidante H2O2 e a variações de sais do meio de cultura. Outros fatores que poderiam ser responsáveis por essas diferenças como a liberação de vesículas de gás e a produção de bacteriorodopsina foram descartados. Também foram identificadas diferenças no pH diante das transições metabólicas promovidas por mudanças na disponibilidade de nutrientes e luz. Ao analisar a sobrevivência da linhagem nocaute em concentrações semi-letais de Cu 2+ , AsO 2 - e PQT não observamos diferenças em relação a linhagem controle, sugerindo que no prévio condicionamento ao estresse, VNG_RS05855 não participe nas respostas adaptativas. De acordo com análises do transcritoma, a ausência do gene VNG_RS05855 afetou a expressão de 117 genes, 44% deles sem função conhecida. Entre os que se conhece a função se destacam os transcritos relacionados às vesículas de gás e transporte. Na produção das vesículas de gás, as análises da cobertura de reads sugerem que a participação de VNG_RS05855 esteja relacionada a regulação antisense. A expressão de genes relacionados ao transporte nos indica que o metabolismo do RNA é complexo e o impacto do VNG_RS05855 na regulação pós-transcricional, heterogêneo. Dentre os transportadores com expressão afetada estão os relacionados às respostas a arsênico, sugerindo o seu papel na resposta adaptativa frente a este metalóide. A análise de sítios de processamento utilizando dados de transcritoma (TPS-transcriptional processing sites) indica a influência diferencial no processamento dos transcritos dos replicons de H. salinarum NRC-1, com VNG_RS05855 atuando menos nos transcritos derivados do cromossomo que nos dos megaplasmídeos. Além disso, observamos o processamento preferencial de transcritos longos, apoiando a expressão diferencial de transcritos dentro de unidades policistrônicas. A estruturação dos RNAs poderia contribuir para sinalizar o grau de processamento promovido por VNG_RS05855. A obtenção da proteína heteróloga e os testes de atividade mostraram com clareza o papel ribonucleolítico in vitro do VNG_RS05855, tornando-se o primeiro retrato deste tipo de atividade em proteínas metalo-β-lactamases que carecem de domínio exosite na classe Halobacteria.