NtCDKG;2, uma proteína multifuncional, relacionada aos processos de transcrição, processamento de RNA e organização do fuso acromático no ciclo celular de Nicotiana tabacum

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Lubini, Greice
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: achromatic spindle; BiFC; CDK; cell cycle; ciclo celular; fuso acromático; localização subcelular; SCI1; subcellular localization; Y2H
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-06062017-171202/

Os estudos em reprodução e desenvolvimento das plantas, especialmente voltados ao pistilo, são de grande interesse agronômico, econômico e científico. Em nosso laboratório, recentemente, foi identificado e caracterizado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), um inibidor do ciclo celular que atua de forma tecido específica no pistilo de Nicotiana tabacum L. e Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (DEPAOLI et al., 2011; DEPAOLI; DORNELAS; GOLDMAN, 2014). Foi identificada a proteína NtCDKG;2 (N. tabacum Cyclin-dependent Kinase 2) como parceira de interação de NtSCI1 (N . tabacum SCI1), em um ensaio de pull-down (STRINI, 2014). A literatura aponta que os inibidores de ciclo celular regulam o ciclo através da inibição de CDK, o que sugere que NtSCI1 possa regular o ciclo celular através da inibição de NtCDKG;2. O presente estudo mostra análises detalhadas da localização de GFP-NtCDKG;2 em células epiteliais de N. benthamiana. Verificou-se que a proteína NtCDKG;2 está presente no nucleoplasma e também co-localiza em speckles nucleares. Em cultura de células BY2 expressando GFP-NtCDKG;2 de forma estável, foi observado que, durante a metáfase e anáfase, a proteína NtCDKG;2 está junto ao fuso acromático. Adicionalmente, ensaios de BiFC (Bi-molecular Fluorescence Complementation) realizados neste trabalho mostram que a interação entre as proteínas NtCDKG;2 e NtSCI1 ocorre em uma região localizada na periferia nucleolar, durante a interfase. Também foram identificadas possíveis isoformas de NtCDKG;2. A possibilidade da ocorrência de isoformas sugere que, de maneira análoga à sua homóloga em humanos, as isoformas resultantes de NtCDKG;2 possam atuar em diferentes processos. Em busca de parceiros de interação de NtCDKG;2, para identificar em que vias esta proteína atua, foi realizado um screening de uma biblioteca de cDNAs de estigmas e estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido em leveduras (Y2H). Através desse ensaio, foram identificados diversos parceiros envolvidos com transcrição e processamento de RNA. Dentre as proteínas identificadas, cuja interação foi confirmada neste trabalho, destaca-se a proteína NtCDKF;1, uma proteína que fosforila o CTD da RNA Polimerase II e, dessa forma, auxilia a transcrição e o splicing cotranscricional (HAJHEIDARI et al., 2012). O presente trabalho mostra também a interação entre NtCDKG;2 e a proteína NtCBP1, uma proteína que possui um papel importante na regulação inicial da transcrição de proteínas mediadoras do crescimento do tubo polínico (LI et al., 2015). xx Adicionalmente, o screening de Y2H possibilitou a identificação da interação entre NtCDKG;2 e NtRanBP1, uma proteína chave na formação do fuso acromático que, em humanos, interage com uma isoforma homóloga a NtCDKG;2, a CDK11p46 (MIKOLAJCZYK et al., 2003; YOKOYAMA et al., 2008; ZHANG; DAWE, 2011). Análises in silico realizadas com a sequência de aminoácidos de NtCDKG;2 apontaram motivos de interação com proteína do tipo F-Box, ciclina, CDK, fosfatase, 14-3-3, BRCA1 e indicaram o local provável de interação do complexo CDK-Ciclina com o respectivo inibidor. Foi testada e comprovada a interação entre NtCDKG;2 e a 14-3-3D, por Y2H, uma parceira de NtSCI1. Outra lacuna que precisava ser preenchida é referente à regulação da expressão de NtSCI1. Com este intuito, foram realizadas análises in silico para identificar elementos cis-regulatórios na sequência genômica de NtSCI1. Essas análises indicaram a presença de importantes elementos cis-regulatórios relacionados à identidade meristemática (como WUSCHEL e AINTEGUMENTA), identidade do carpelo (AGAMOUS, BELL) e progressão do ciclo celular (E2F e CDC5). Algumas considerações podem ser feitas associando os resultados obtidos a estudos feitos paralelamente em nosso laboratório: 1) Compilando a localização de NtCDKG;2 em splicing speckles e sua interação com os diferentes parceiros de interação relacionados à transcrição e splicing, sugere-se que NtCDKG;2 também atue nos processos transcricionais e de splicing. 2) Considerando a localização subcelular de NtCDKG;2 durante as diferentes fases do ciclo celular, às análises in silico dessa proteína que identificaram sua possível interação com BRCA1, além da interação confirmada com a proteína NtRanBP1, é possível sugerir que NtCDKG;2 atue, direta ou indiretamente, na organização do fuso acromático de plantas. 3) Propõem-se que NtSCI1 regule a proliferação celular no pistilo através da interação com NtCDKG;2 que se dá no nucléolo das células. Dessa forma, NtSCI1 prenderia NtCDKG;2 no nucléolo e inibiria sua atuação, como na organização do fuso acromático, o que acarretaria inibição da divisão celular. 4) Devido aos motivos cis-regulatórios encontrados na sequência genômica de NtSCI1 e o efeito que a proteína possui desde as fases iniciais do desenvolvimento do pistilo, sugere-se que a expressão desse gene seja regulada por elementos diretamente envolvidos no controle do término do meristema floral e nas vias de desenvolvimento de órgãos florais.