Estabelecimento de sistemas de cultivo tridimensionais (3D) utilizando células de câncer de ovário como plataforma para ensaios de toxicidade

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Tofani, Larissa Bueno
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: 3D cell culture; Alginate encapsulation; Câncer de ovário; Co-culturas; Co-cultures; Cultivo celular 3D; Encapsulação em alginato; Esferoides; Flutuação forçada; Forced floating; Hanging-drop; Ovarian cancer; Spheroids
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-22092021-143825/

Para que um novo medicamento chegue ao mercado, estima-se que sejam necessários 10 anos de desenvolvimento com um custo aproximado de 2,6 bilhões de dólare. Além disso, a determinação da toxicidade desse medicamento durante seu desenvolvimento corresponde a um dos principais desafios, uma vez 98% dos novos candidatos a fármacos falham em segurança e eficácia. Embora modelos in vivo tenham sido amplamente utilizados para avaliar a toxicidade de diferentes susbtâncias, diversas limitações estão associadas à sua utilização como alto custo, elevado número de animais, variabilidade de procedimentos empregados e aspectos éticos. Em função disso, ensaios in vitro baseados em cultura de células vêm sendo utilizados por apresentar um melhor custo-benefício, maior reprodutibilidade e possibilidade de aplicação em plataformas de triagem automatizada em larga escala (HTS). No entanto, uma vez que o cultivo celular em monocamada (2D) tradicional pode não predizer de maneira adequada o que ocorre no ambiente in vivo, a utilização do cultivo celular tridimensional (3D) está ganhando cada vez mais importância, por reproduzir diversas características do ambiente nativo, tais como: heterogeneidade celular, interação célula-célula e célula-matriz extracelular, perfil de expressão gênica, cinética de crescimento, perfil de resistência à fármacos, dentre outros. O câncer de ovário é o sétimo tumor mais comum, sendo que o principal desafio durante seu tratamento é a frequente quimioresistência adquirida pelas pacientes. Este trabalho teve como objetivo avaliar diferentes técnicas de cultivos 3D utilizando células de adenocarcinoma de ovário (SKOV-3 e OVCAR-3) com o intuito de estabelecer um modelo in vitro para ensaios de toxicidade com maior capacidade preditiva. Para isso, o cultivo celular 3D foi realizado na forma de esferoides utilizando as técnicas de flutuação forçada (FF) e hanging-drop (HD) em mono (SKOV-3 e OVCAR-3) e co-cultura (SKOV-3:células mesenquimais-MCU-9 e SKOV-3:fibroblastos-CCD27-Sk) e em sistemas híbridos (esferoides obtidos em biorreatores do tipo spinner encapsulados em matriz de alginato) em mono (SKOV-3) e co-cultura (SKOV-3:fibroblastos-HDFs). Os esferoides obtidos nos diferentes sistemas foram avaliados em função de sua morfologia (diâmetro, circularidade e estrutura organizacional), crescimento e viabilidade celular, perfil de expressão gênica e resposta após exposição ao fármaco Paclitaxel. Inicialmente, esferoides obtidos com as células SKOV-3 e OVCAR-3 apresentaram-se pouco compactos e, em função disso, foi necessária a aplicação de um estímulo externo à técnica FF (centrifugação da placa ULA) e adição da metilcelulose (MC) ao meio de cultura (0,25% e 0,5%, p/v). Após adição da MC (FF e HD), esferoides mais esféricos com diâmetros em torno de 200-500 μm, com maior número de microvilosidades, menor taxa de crescimento e maior conteúdo apoptótico foram obtidos, quando comparado ao cultivo 2D. Co-culturas (SKOV-3:MCU-9 e SKOV-3:CCD27-Sk) obtidas utilizando a técnica FF também formaram esferoides regulares com diâmetros em torno de 200-500 μm, com maior presença de microvilosidades. A associação das células SKOV-3 com células mesenquimais em 3D propiciou uma melhor recapitulação do ambiente tumoral in vivo devido ao perfil de expressão dos genes avaliados (MMP-2, MMP-9, HIF1-α, VEGF, SNAIL, ZEB1, vimentina e β-catenina). Todos os sistemas 3D (FF e HD) apresentaram maior resistência após exposição ao fármaco Paclitaxel, quando comparado ao cultivo em 2D. Já o sistema híbrido obtido após formação dos esferoides em biorreatores do tipo spinner (SKOV-3) propiciou um maior número esferoides ao final de 21 dias de cultivo, quando comparado às técnicas FF e HD, com manutenção da viabilidade celular durante todo o cultivo. Não foi observada a fusão dos esferoides ao longo da cultura após encapsulação em alginato. Assim como para os sistemas estáticos (FF e HD), as cápsulas em mono-SKOV-3 (IC50= 11,48 μg/mL) e co-cultura- SKOV-3:HDFs (IC50 = 17,63 μg/mL) demonstraram maior resistência ao Paclitaxel, quando comparadas ao cultivo 2D (IC50 = 5,13 μg/mL). Os resultados apresentados ao longo deste trabalho sugerem que a co-cultura SKOV-3:MCU-9 apresenta melhores características para ensaios drug screenig em um curto período, em função da facilidade de obtenção, recapitulação da resposta celular in vivo e custo-benefício. Já a co-cultura em sistema híbrido SKOV-3:HDFs pode ser utilizada para ensaios a longo termo, em função da viabilidade e resposta da cultura. Além disso, os resultados obtidos podem contribuir para a consolidação e padronização dos sistemas de cultivo celular 3D para o screening de novos fármacos para o tratamento do câncer.