Estudo das bases moleculares da especificidade pelo substrato de uma beta-glicosidase (AF052729) de Spodoptera frugiperda

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Rozenfeld, Julio Henrique Kravcuks
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Biochemistry; Bioquímica; Enzima; Enzyme; Spodoptera frugiperda
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-19092006-163823/

A beta-glicosidase digestiva (Mr 50.000) de Spodoptera frugiperda (Sfgli50) possui em seu sítio ativo resíduos de aminoácido que interagem de forma não-covalente com o substrato. Essas interações não-covalentes garantem a especificidade da enzima em relação a seus substratos. Esse trabalho visa estudar o papel desses aminoácidos e suas interações com o substrato na especificidade da Sfgli50. Para isso, um modelo de previsão de especificidade baseado nas energias de interação entre diferentes resíduos de aminoácidos das posições 451 e 39 da Sfgli50 e as hidroxilas 4 e 6 do glicone do substrato foi elaborado e testado através da produção e caracterização de três duplos-mutantes (S451N39, S451E39 e A451E39) da Sfgli50. O modelo mostrou-se apropriado qualitativamente para previsão do comportamento da especificidade frente a glucosídeos e galactosídeos, mas totalmente inadequado para previsões de preferência frente a fucosídeos e galactosídeos. Estas conclusões indicaram que pressupostos iniciais do modelo, como independência das interações com o substrato e conservação estrutural do sítio ativo nos mutantes, estavam errados. Analisou-se também a contribuição de outros dois resíduos do subsítio do glicone para a especificidade da Sfgli50: H142 e N186, cujas energias de interação ainda não haviam sido determinadas. Experimentos de mutação sítio-dirigida foram realizados para introduzir resíduos de Alanina nas posições 142 e 186. Os mutantes H142A e N186A foram expressos em bactéria e em seguida parcialmente purificados. O mutante N186A apresentou baixa atividade catalítica, o que limitou sua caracterização. Por outro lado, a determinação de parâmetros cinéticos (Vmáx e Vmáx/Km) mostrou que, em contraste com a Sfgli50 selvagem, o mutante H142A é menos específico, principalmente no que diz respeito a fucosídeos.