Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2012 |
| Autor(a) principal: |
Manzine, Livia Regina |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Tese
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-21032012-093929/
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Resumo: |
Em Escherichia coli a formação e incorporação do aminoácido selenocisteína é um evento cotraducional dirigido pelo códon de terminação UGA e deve se a uma complexa via de biosíntese cujas principais proteínas envolvidas são: Selenocisteína sintase (SELA), Fator de elongação de selenocisteína (SELB), Selenofosfato sintetase (SELD), Seril-tRNAser sintetase, um tRNA de inserção de selenocisteína (tRNAsec ou SELC) e uma sequência específica no RNA mensageiro, denominada de Sequência de inserção de selenocisteína (SECIS). A incorporação de selenocisteína em proteínas bacterianas inicia-se com a aminoacilação do tRNAsec com serina pela enzima Seril-tRNA sintetase formando seril-tRNAsec que é posteriormente convertido a selenocisteil-tRNAsec pela enzima SELA através de selenofosfato. Dessa forma, o trabalho teve seu foco estabelecido na realização de estudos bioquímicos e biofísicos da proteína SELA e na análise da interação dessa proteína com o ligante SELC para determinação de parâmetros de ligação envolvidos na formação desse complexo. O gene codificante para a proteína SELA foi subclonado, expresso em linhagem bacteriana WL81460(DE3) e a proteína SELA foi purificada como descrito na literatura; entretanto, uma nova metodologia para sua purificação foi desenvolvida proporcionando maior rapidez e rendimento. Estudos de filtração em gel, eletroforese nativa, focalização isoelétrica, dicroísmo circular, espectroscopia de fluorescência intrínseca e crosslinking químico proporcionaram uma melhor caracterização da proteína SELA e consequentemente uma maior compreensão de seu comportamento em solução. Ensaios de espectroscopia de anisotropia de fluorescência revelaram que a proteína SELA é capaz de se associar em estruturas superiores ao estado decamérico; essa análise pôde ser corroborada principalmente por dados de microscopia eletrônica empregando a técnica de negative staining. A metodologia de anisotropia de fluorescência também permitiu analisar a interação da macromolécula SELA com o ligante específico SELC, bem como com outros tRNAs mutantes possibilitando a realização de um mapeamento das regiões de SELC importantes para a interação. Além disso, essa técnica também foi satisfatoriamente empregada na determinação da estequiometria de ligação do complexo SELA-SELC revelando a proporção de 1 molécula de SELA para 10 tRNAs, o que contraria dados literários publicados em 1991 e 1992. |
