Potencial de produção de eritropoietina recombinante em linhagens celulares humanas em condições de cultivo em suspensão e meios livres de soro fetal bovino

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Silva, Luciano Costa e
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Cultivo em suspensão; Eritropoietina; Erythropoietin; Glicoproteínas recombinantes; Human cell lines; Lentiviral vectors; Linhagens celulares humanas; Meios isentos de soro fetal bovino; Recombinant glycoproteins; Serum-free suspension culture; Vetores lentivirais
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-24032022-103917/

Atualmente, a maioria das proteínas terapêuticas comerciais é produzida em linhagens de células de mamíferos não humanas. No entanto, linhagens celulares humanas têm alcançado proeminência tanto na academia quanto na indústria. As células humanas são capazes de produzir proteínas recombinantes com modificações pós-traducionais que são mais semelhantes às proteínas nativas. Com o intento de estudar novos sistemas de expressão baseados em células humanas e eliminar o constituinte não humano de produtos biofarmacêuticos, este trabalho teve como objetivo estudar o perfil cinético, metabólico e potencial de produção das linhagens celulares humanas Sk-Hep-1, HKB-11 e Huh-7 cultivadas em suspensão e meio livre de soro fetal bovino (SFB). Foi selecionada a eritropoietina humana (EPO) como proteína modelo para avaliar a produtividade das linhagens celulares. Linhagens celulares recombinantes foram geradas por transdução lentiviral usando um MOI de 1 (multiplicidade de infecção de 1 vírus por célula), posteriormente as células positivas para a expressão da proteína repórter GFP foram separadas e coletadas por citometria de fluxo. A percentagem de células positivas para GFP após o processo de separação foi de 99%, 95% e 90% para as células SK-Hep-1, HKB-11 e Huh-7, respectivamente. Após a geração das linhagens celulares estáveis, foi testado o melhor meio de cultura livre de soro para o crescimento celular e produção de rhEPO. O meio CDM4 CHO foi o melhor meio para as linhagens Sk-Hep-1 e HKB-11 e o meio Freestyle, para a linhagem Huh-7. Foram caracterizados o número de cópias do gene da EPO por célula, a expressão do RNAm da EPO, a cinética de crescimento celular, o metabolismo e a produção de rhEPO. Todas as células apresentaram altas taxas de crescimento celular específico e altos níveis de produção de rhEPO quando comparadas à literatura. A concentração celular máxima alcançada pelas células Sk-Hep-1, HKB-11 e Huh-7 foi de 2,1 x 10^6 células/mL, 5,7 x 10^6 células/mL e 4,3 x 10^6 células/mL, com taxa de crescimento específico máxima de 0,023 h-1, 0,022 h-1, 0,031 h-1 e uma concentração máxima de rhEPO de 112,35 µg/mL, 112,0 µg/mL e 571 µg/mL, respectivamente. A rhEPO produzida pelas células humanas foi capaz de diferenciar células CD34+ em células eritróides terminalmente diferenciadas, demonstrando assim sua funcionalidade. Com este trabalho, foi possível descrever as características cinéticas, metabólicas e a produtividade de três linhagens celulares humanas adaptadas para o cultivo em meio em suspensão e livre de SFB, contribuindo assim, tanto com estudo das linhagens celulares humanas quanto para a avaliação do uso das mesmas como alternativa para a produção industrial de glicoproteínas recombinantes.