A proteína ligadora de glutamanto (GlnH) de Streptococcus mutans como alvo no desenvolvimento de estratégias vacinais de mucosa contra cárie dental humana

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Pereira, Gisela de Souza
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Streptococcus mutans; ABC transporters; adjuvante imunológico; cárie dental; dental caries; immunization; immunologic adjuvant; immunosignature; imunização; imunoassinatura; P1 protein; proteína P1; subunit vaccines; transportes ABC; vacinas de subunidades
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-09122020-052642/

A cárie dental é uma doença infecciosa com ampla distribuição mundial que tem como principal agente etiológico o Streptococcus mutans (S. mutans). Apesar dos esforços para desenvolvimento de uma vacina, não há disponível no mercado um produto para a utilização em humanos. O presente trabalho tem como objetivo o estudo de estratégias vacinais de mucosa utilizando novos alvos vacinais: a proteína GlnH e duas regiões da proteína P1 localizadas nas porções N-terminal e C-terminal, compreendendo as proteínas recombinantes P139-512 e P3C, respectivamente. A proteína GlnH é o componente ligante de glutamato/glutamina dos transportadores do tipo ABC, relacionada com a expressão de fatores associados à virulência. Os genes sintéticos, que codificam para a proteína GlnH completa (GlnHco) e dois fragmentos derivados dela: região N-terminal (nGlnH) e C-terminal (cGlnH), foram desenhados de forma a adaptar o uso de códons para a expressão em Bacillus subtilis (B. subtilis). e remoção do sítio de ligação ao substrato. Esses genes foram subclonados no vetor pHT08 e as proteínas, expressas pelas linhagens recombinantes de B. subtilis. Todas as proteínas apresentaram mobilidade alterada em gel de poliacrilamida, mesmo após serem submetidas a diferentes tratamentos com agentes desnaturantes/dissociativos. A ausência de alteração na mobilidade eletroforética após os tratamentos sugeriu que as proteínas se apresentavam como monômeros e que, possivelmente, o fenômeno seria decorrente da composição de aminoácidos das proteínas. Por fim, foi feita a purificação da proteína GlnHco e geração de soros policlonais para a utilização em ensaios de imunodetecção. Os anticorpos séricos gerados em camundongos imunizados com rGlnH interferiram na adesão de bactérias à cavidade bucal de camundongos não imunizados desafiados com S. mutans. Além disso, os camundongos ativamente imunizados com rGlnH foram parcialmente protegidos da colonização oral após o desafio com a cepa S. mutans NG8. Portanto, nossos resultados indicam que a proteína rGlnH de S. mutans é um potencial antígeno-alvo capaz de induzir respostas protetoras de anticorpos após administração sublingual. A P1 de S. mutans é a principal proteína envolvida na adesão bacteriana à superfície dental e, consequentemente, ao desenvolvimento da cárie dentária. As duas regiões de ligação à saliva (SBR) têm sido estudadas como alvos vacinais, mas não a comparação ou combinação entre elas. Neste estudo também avaliamos o potencial de uma abordagem vacinal baseada na administração intranasal e empregando as proteínas recombinantes P139-512 e P3C, isoladas ou em associação. Além disso, monitoramos pela imunoassinatura dos anticorpos gerados a resposta individual dos animais protegidos. Inicialmente, clonamos, expressamos e purificamos com sucesso a proteína P3C na linhagem recombinante de B. subtilis. A P3C recombinante preservou a região de ligação à saliva e, em associação com a P139-512, não restaurou a estrutura tridimensional complexa que pode mascarar os epítopos inibidores de aderência importantes. Após a imunização intranasal, observamos níveis mais elevados de anticorpos antígeno-específicos quando na presença do adjuvante LTK63, quer com as proteínas isoladas ou em combinação. A coadministração das duas proteínas mostrouse deletéria e reduziu os níveis de anticorpos gerados contra o sítio de ligação N-terminal, mas não contra o fragmento C-terminal. Respostas imunológicas protetoras foram observadas apenas em animais imunizados com a proteína P139-512. Os animais imunizados com a proteína P3C tiveram um discreto aumento na colonização de S. mutans quando comparados ao grupo controle. Com a tecnologia de imunoassinatura, foi possível distinguir animais protegidos de animais não protegidos, mesmo entre animais do mesmo grupo. Ao final, aplicamos a assinatura protetora para identificar qual animal estaria protegido da colonização por S. mutans. Em resumo, demonstramos que o uso do sítio de ligação à saliva N-terminal tem maior potencial para proteger os animais contra colonização pelo patógeno oral S. mutans.