Caracterização molecular da etiologia infecciosa de casos de meningites e encefalites agudas atendidos no município de São Paulo

• Ano de defesa: 2025
• Autor(a) principal: Ferreira, Noely Evangelista
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Encefalite; Meningite viral; Metagenômica; Metagenomics; Multiplex polymerase chain reaction; Reação em cadeia da polimerase multiplex; Viral encephalitis; Viral meningitis
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5134/tde-08102025-145021/

Introdução e Objetivos: Meningites e encefalites representam um grande problema de saúde pública global. A maioria dos quadros de meningites e encefalites é de origem infecciosa, e as infecções virais constituem a principal etiologia envolvida. Em todo o mundo, significativa proporção de pacientes com meningites (15 a 60%) ou encefalites (40 a 70%) não têm a identificação do agente etiológico envolvido nessas situações. Dados do Ministério da Saúde do Brasil, apontam uma escassez de informações seguras, a respeito da etiologia envolvida em grande parte dos casos de meningites e encefalites diagnosticados em nosso país. A principal barreira ao diagnóstico etiológico é a dificuldade de acesso a testes diagnósticos rápidos e com baixo custo. O objetivo do presente estudo foi o desenvolvimento, otimização e aplicação prática de diferentes ensaios de biologia molecular para investigação etiológica em casos agudos de infecções do sistema nervoso central (SNC). Metodologia: Foram incluídas amostras de líquor (LCR) de 600 pacientes com quadros de meningites, encefalites ou meningoencefalites agudas, com suspeita de origem infecciosa, atendidos em diferentes serviços de saúde na cidade de São Paulo, entre março de 2018 a novembro de 2019. O estudo foi dividido em três etapas: Etapa1- Otimização de ensaios monoplex por reação em cadeia da polimerase (PCR) para 29 alvos de interesse: Herpesvírus simplex (HSV 1,2), Enterovírus (EV), Parechovírus (HePV), vírus Varicela-zoster ou Herpesvírus 3 (VZV ou HSV 3), vírus Epstein-barr vírus (EBV), Citomegalovírus (CMV), Herpesvírus 6 e 7 (HHV6 e HHV-7 ou HSV 6,7), vírus da Caxumba (Cax), vírus da Imunodeficiência humana (HIV), vírus Influenza A e B (FLUA e FLUB), Poliomavírus (JCV e BKV), Adenovírus (HAdV), Primate Eritroparvovírus 1 B19 (B19), vírus do Sarampo (Sar), vírus Zika (ZIKV), vírus Chikungunya (CHIKV), vírus da Dengue 1-4 (1-4 DENV), vírus da Febre amarela selvagem (YFW), vírus da Febre amarela vacinal (YFV), vírus Mayaro (MAYV), vírus do Nilo ocidental (WNV) e Listéria (Lm). Esse foi o momento inicial do projeto e os monoplex otimizados foram aplicados nas 600 amostras do estudo. Etapa 2 Desenvolvimento de ensaios multiplex de PCR em tempo real para a detecção de EV, HePV, HSV1, 2 e 3 e a otimização de um ensaio para detecção de Arbovírus (Pan-flavivírus e Pan-alphavírus) nas mesmas amostras. Etapa 3- Foi realizado o sequenciamento genômico de nova geração por metagenômica (mNGS) nas amostras que após passarem pelas etapas 1 e 2 do estudo, ainda continuaram sem uma etiologia definida. Nessa etapa, foram incluídas 308 amostras. Resultados: Etapa 1- Os testes de PCR em tempo real otimizados, apresentaram eficiência em torno de 98-99%, alcançando limites de detecção menores ou iguais a 20 cópias por reação. A validação dos testes desenvolvidos foi feita em relação a plataformas comerciais ou utilizando-se controles biológicos preparados, evidenciando-se concordância em torno de 90 a 100%. Através do algoritmo diagnóstico proposto ao início do estudo, fomos capazes de determinar a etiologia infecciosa em 292 dos 600 casos incluídos (48,6%), sendo que entre esses casos 227 (77,7%) foram compostos por diferentes vírus. EV (n=144) e HSV 1,2 (n=14) foram os agentes mais frequentemente identificados. HIV (n=15), EBV (n=13), HSV 6,7 (n=6), Caxumba (n=4), Sarampo (n=1) e BKV (n=1) foram também identificados por PCR. Em 65 indivíduos (22,3%), 87 patógenos não virais foram identificados, incluindo dupla ou múltiplas infecções. Diferentes bactérias, foram identificadas por cultura ou PCR. Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Schistosoma mansoni e Toxoplasma gondii, foram também identificados. Etapa 2- Os dois testes multiplex PCR em tempo real desenvolvidos para Picornaviridae, incluindo o controle interno (Enterovírus, Parechovírus e RNAseP) e multiplex para Herpesvírus (HSV-1,2 e VZV) e otimizado para Pan-arbovírus em comparação a resultados observados com plataformas comerciais e controles, apresentaram concordância em torno de 90 a 100%. Etapa 3- A metagenômica (mNGS) realizada em 279 dos 308 casos remanescentes sem diagnóstico, revelou uma variedade de outras etiologias infecciosas potenciais. Infecções adicionais por EV, B19 e Toxoplasma, bem como, sequencias parciais para outros microrganismos, foram detectadas. Ainda por mNGS, identificamos sequências genômicas do Picobirnavírus, um vírus geralmente descrito em fezes e secreções respiratórias. Sua presença foi confirmada por PCR. O Vesivírus canino, também foi identificado pela primeira vez na literatura, em amostras humanas de LCR. Conclusões: 1- Nossos dados confirmaram o EV e Herpesvírus (HSV) como uma das principais causas de infecções do SNC no Brasil. 2- A aplicação de um teste de PCR multiplex em tempo real, auxilia na realização de um diagnóstico rápido e eficiente das principais etiologias virais associadas a infecções de SNC em nosso meio. 3- A utilização da metagenômica amplia de forma expressiva a investigação de etiologias adicionais destas afecções e pode contribuir nas investigações relativas à evolução e vigilância genômica dos microrganismos, auxiliando inclusive no enfrentamento de futuras pandemias.