Estrutura, expressão e análise funcional do gene codificando Calmodulina no fungo aquático Blastocladiella emersonii

• Ano de defesa: 2000
• Autor(a) principal: Simão, Rita de Cássia Garcia
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Biologia molecular; Blastocladiella emersonii; Expressão gênica; Gene expression; Molecular biology
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-05072019-182508/

O único gene para Calmodulina (CaM) e o cDNA correspondente do quitridiomiceto Blastocladiella emersonii foram isolados e caracterizados. O gene CaM é interrompido por três introns e transcrito como uma única espécie de mRNA de 0,7 kb, codificando uma proteína 91% idêntica à CaM humana. A Calmodulina de B. emersonii foi expressa em Escherichia coli como uma proteína de fusão com Glutationa-S-transferase (GST), purificada por cromatografia de afinidade e clivada da porção GST usando uma protease sítio específico. Na presença de Ca2+, a CaM de B. emersonii exibiu uma alteração na mobilidade eletroforética semelhante à CaM bovina e foi capaz de ativar a autofosforilação da proteína quinase dependente de Ca+2-CaM (CaMKII) de cérebro de rato. A expressão da Calmodulina é regulada durante o desenvolvimento em B. emersonii, o mRNA da CaM e a concentração da proteína aumentam durante a esporulação atingindo um nível máximo antes da liberação dos zoósporos no meio, no final deste estágio. Os níveis da proteína e do mRNA decrescem drasticamente no estágio de zoósporo aumentando novamente durante a germinação. Os antagonistas de CaM, composto 48/80, calmidazolium e W7 inibiram completamente a esporulação de B. emersonii quando adicionados às culturas pelo menos 120, 150 e 180 min após a indução, respectivamente. Todas estas drogas também inibiram o crescimento e a produção de zoósporos neste fungo. O bloqueador de canais de Ca+2 , TMB-8, e o inibidor de CaMKII KN93 inibiram completamente a esporulação quando adicionados até 60 minutos após a indução deste estágio, porém apenas KN93 afetou o crescimento do fungo. Os dados apresentados sugerem que o complexo Ca+2-CaM e a CaMKII têm um papel importante durante o crescimento e esporulação em B. emersonii.