Padronização da técnica SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking) utilizando a proteína Cas13a para diagnóstico do Vírus Respiratório Sincicial em pacientes pediátricos

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Soares, Camila Pereira
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: CRISPR-Cas; Diagnosis; Diagnóstico; ELISA; RSV; SARS-CoV-2
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-07062024-145303/

O RSV é um vírus amplamente distribuído no mundo e é o principal vírus envolvido em infecções respiratórias do trato inferior. A principal população de risco dessas infecções são crianças menores de 5 anos. Nesse contexto, os métodos de diagnósticos laboratoriais se apresentam extremamente importantes devido a similaridade entre os sintomas causados pela infecção do RSV com outros vírus respiratórios. Esse trabalho propôs utilizar a enzima LwCas13a como detectora do RSV em amostras de pacientes pediátricos tendo como base a técnica SHERLOCK. A proteína recombinante foi obtida utilizando cromatografia de afinidade e gel filtração para purificação. O RNA alvo foi desenhado com base em uma região conservada no gene M do RSV. Em amostras clínicas previamente amplificadas por PCR convencional, 100% foram detectadas pela enzima e em amostras sem amplificação prévia 45,3% foram detectadas. Não houve reação cruzada em nenhum dos testes com outros vírus de importância respiratória. Durante o enfrentamento à Covid-19 em 2020 e 2021, produzimos um teste de ELISA para detectar anticorpos IgG/IgA/IgM contra duas nucleoproteínas recombinantes, uma comercial e uma produzida in house. Os teste foi padronizado em comparação ao ensaio padrão ouro de neutralização viral (VNT100 ). Para todas as três imunoglobulinas obtivemos valores acima de 88% de sensibilidade e 94% de especificidade. O ensaio foi empregado na triagem de doadores e receptores de plasma convalescente, no diagnóstico fornecido para 7 hospitais público da cidade de São Paulo. Além disso, padronizamos um ensaio ELISA para IgG utilizando sangue capilar seco coletado em papel de filtro. Na tentativa de facilitar a coleta de amostras em um cenário de pandemia.