Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2008 |
| Autor(a) principal: |
Dinamarco, Taísa Magnani |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Tese
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-21102008-102221/
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Resumo: |
O Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso e saprofítico, encontrado em todas as regiões do mundo, desempenhando um importante papel na reciclagem de carbono e nitrogênio do solo. A principal forma de infecção ocorre através da inalação dos conídios com predominância de infecções no trato respiratório, principalmente em pacientes imunocomprometidos. A mitocôndria de A. fumigatus foi caracterizada em nosso laboratório, que revelou a presença de uma respiração resistente a cianeto mediada pela oxidase alternativa. A clonagem e sequenciamento deste gene foram realizadas através de screening de uma biblioteca de DNA genômico. O alinhamento das sequências genômica e de cDNA mostrou a presença de dois introns, que após splicing codifica uma proteína contendo 352 aminoácidos, possuindo uma massa molecular estimada de 40,84 kDa e um pI teórico de 9,51. Além disso, foram identificados domínios altamente conservados (LET, NERMHL, LEEA e RADEH) que interagem com átomos de ferro e estão contidos em -hélices propostas como responsáveis pela organização estrutural da enzima. A fim de caracterizar bioquimicamente esta proteína, a sequência de cDNA do gene foi clonada em plasmídeo pYES2 e expressa em S. cerevisiae INVSc1 como um modelo eucarioto. Após expressão, a proteína encontrou-se de forma ativa, conferindo à levedura uma respiração resistente a cianeto. Esta característica herdada provocou uma discreta diminuição na taxa de crescimento em meio não-fermentativo e uma capacidade de sobrevivência na presença de KCN. Acredita-se que a atividade das AOXs esteja diretamente relacionada com a presença de diferentes espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste contexto, a avaliação do efeito de diferentes agentes pró-oxidantes provocou um aumento na atividade e na expressão da enzima. Paralelamente, a caracterização funcional do gene foi realizada através da técnica de interferência por RNA, utilizando o vetor de expressão pALB1. Em meio contendo maltose, as cepas pALB1/aoxAf apresentaram coloração branca devido ao silenciamento do gene alb1. Os níveis de mRNA do gene aoxAf foram determinados por Real time RT-PCR, mostrando o eficiente silenciamento do gene alvo com a construção utilizada. Devido à relação já descrita entre ERO e a atividade das AOXs, avaliou-se a produção de espécies reativas de oxigênio nas cepas silenciadas utilizando-se a sonda CM-H2DCFDA, observando maior produção na cepa pALB1/aoxAf. Além disso, a viabilidade destas cepas foi determinada por citometria de fluxo após a exposição com agentes pró-oxidantes, a qual indicou maior letalidade na cepa pALB1/aoxAf, quando comparada com CEA e pALB1. Da mesma forma, após a incubação dos conídios das cepas silenciadas com macrófagos de camundongos foi verificada uma maior atividade microbicida dos macrófagos na cepa duplamente silenciada pALB1/aoxAf, quando comparada com as outras cepas. Com estes resultados podemos concluir que a oxidase alternativa apresenta uma importante atividade antioxidante, além de contribuir nos mecanismos de defesa durante o processo de infecção de A. fumigatus. |
