O papel da proteína SET no perfil de metilação do miR-9 e no reparo de DNA em células humanas de carcinoma espinocelular oral

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Tannous, Maryna Aguilar
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: ATM; DDR; DNA repair; DSB; Metilação de miRNA; miRNA methylation; Reparo de DNA; SET/I2PP2A/TAF-IB
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60135/tde-27112014-092603/

O início e a progressão do carcinoma espinocelular oral (CEO) são caracterizados pela aquisição de alterações genéticas e epigenéticas. A proteína SET é descrita como uma oncoproteína e, recentemente, o seu acúmulo foi mostrado em CEO. Diversas funções têm sido atribuídas à SET, tais como controle do ciclo celular, sobrevivência celular, migração celular, acetilação de histonas, e resposta ao estresse oxidativo. Este contexto sugere a SET como alvo terapêutico, mas primeiramente, é essencial entender a sua ação na tumorigênese e progressão em CEO. A hipótese central no presente estudo refere-se ao papel da SET na instabilidade genômica e reparo de DNA, bem como na regulação epigenética da expressão de miRNA, com impacto no desenvolvimento e progressão de CEO. O silenciamento estável de RNA foi realizado usando plasmídeo contendo short hairpin RNA contra SET (shSET) em linhagens de CEO in vitro (HN12 e Cal27) e in vivo (tumores xenoenxerto de HN12). Efeitos da redução da SET em CEO, in vitro e in vivo, foram avaliados no perfil de metilação (MSP, methylation specific PCR), expressão de miR-9 (qRT-PCR) e reparo de DNA (reparo mismatch e de quebra de fita dupla - DSB). A instabilidade genômica foi abordada por meio de cinco microssatélites (PCR convencional) para avaliar a instabilidade de microssatélites (MSI), e ensaio cometa para avaliar danos ao DNA (SSB, DSB, cross-link, etc.). O status de proteínas envolvidas em reparo de DSB (ATM, BRCA1 e MLH1) foi avaliado por imunofluorescência e Western blotting (WB). A resposta aos danos no DNA (DDR) induzidos por radioterapia (raios-X) foram analisados nas células HN12 por meio de ensaios clonogênico e de ciclo celular; proteínas associadas à apoptose, autofagia, ciclo celular e reparo foram avaliadas por WB. A redução da SET nas células HN12 modificou a transcrição dos loci codificantes do miR-9 por meio da reversão parcial de hipermetilação, tanto in vitro quanto in vivo, para o locus miR-9-1, e in vitro para o miR-9-3, com aumento nos níveis de miR-9 e miR-9*. A análise de 5 microssatélites mostrou alteração no perfil alélico de dois marcadores, D5S346 e D2S123, nas células HN12 shSET e nos tumores xenoenxerto da HN12 shSET (in vivo) em relação aos respectivos controles, o que sugere a presença de MSI e é um indício do papel da SET no reparo de DNA tipo mismatch. A linhagem HN12 shSET apresentou diminuição de danos no DNA e aumento das proteínas de reparo de DSB, MLH1, ATM, p-ATM e BRCA1 em relação a células HN12 shCTRL. Na DDR induzida por raios-X as células HN12 shSET apresentaram nas primeiras 48 horas uma menor perda de viabilidade (menor % em sub G0/G1), com parada em G2/M, maior nível de ATM ativa, aumento dos níveis de p21 e LC3B-II, além de menor clivagem de PARP e caspase-8 em relação as células HN12 shCTRL; isto sugere uma melhor resposta a danos de DSB e ativação de vias de sobrevivência nas células HN12 shSET. Entretanto, após 12 dias de radioterapia as células HN12 shSET mostraram uma tendência a menor sobrevivência. Portanto, os nossos resultados indicam o envolvimento da SET na regulação transcricional do miR-9, nas vias de reparo do tipo mismatch e de DSB em CEO, com potenciais implicações tanto na tumorigênese quanto na progressão da doença.