Reconstituição da Anexina V em sistemas de lipossomos: associação com a fosfatase alcalina e correlação com estudos de biomineralização

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Bolean, Maytê
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Alkaline phosphatase; Anexina V; Annexin V; Biomineralização; biomineralization; Fosfatase Alcalina; lipids rafts; Lipids Rafts.; liposome; Lipossomo; proteoliposome; Proteolipossomo
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-04062014-110227/

A biomineralização óssea é um processo complexo e multifatorial sendo um grande desafio para a ciência à compreensão dos seus mecanismos regulatórios. Este processo é mediado pela liberação de vesículas da matriz (MVs), as quais surgem das superfícies de osteoblastos e são secretadas no local específico do início da biomineralização. MVs têm a capacidade de acumular altas concentrações de íons Ca2+ e fosfato (Pi), proporcionando um microambiente adequado para a formação inicial e propagação dos cristais de hidroxiapatita. Especial atenção deve ser dada a duas proteínas: Anexina V (AnxA5) e Fosfatase Alcalina (TNAP). As anexinas são as proteínas mais abundantes detectadas nas MVs e responsáveis pela formação de canais de cálcio. TNAP apresenta atividade fosfomonohidrolítica, produzindo Pi a partir, principalmente, de pirofosfato (PPi) e ATP. O enfoque deste projeto foi produzir e caracterizar proteolipossomos com diferentes composições lipídicas de dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) e dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS) contendo TNAP e AnxA5, e manter a funcionalidade das proteínas após incorporação nos sistemas miméticos. Foi possível incorporar AnxA5 em DPPC-proteolipossomos (11,64 µg/mL), mas na presença de DPPS houve um aumento significativo de AnxA5 incorporada (25,79 µg/mL) a DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar). A presença das proteínas nos proteolipossomos compostos por DPPC e DPPC:DPPS 5, 10 e 15% (razão molar) foi confirmada por SDS-PAGE e Immunoblotting. Melhores rendimentos de incorporação das duas proteínas foram obtidos quando ambas foram incorporadas concomitantemente. DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteoliposomos revelaram conter 75% de AnxA5 e 25% de TNAP em concentração de proteína. A presença de DPPS não afetou significativamente as porcentagens de proteínas incorporadas. Os parâmetros cinéticos da TNAP na hidrólise de diferentes substratos fisiológicos (ATP, ADP e PPi) foram determinados na presença e ausência de AnxA5, em pH fisiológico, e para os diversos sistemas lipídicos. A melhor eficiência catalítica da enzima foi obtida para sistemas contendo 10% de DPPS (razão molar) (kcat/K0.5= 183,02; 776,06 e 657,08 M-1.s-1, respectivamente). A TNAP apresentou maior especificidade para a hidrólise de PPi quando comparado com ATP e ADP. Estudos utilizando Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) mostraram que o aumento da concentração de DPPS em DPPC-lipossomos proporcionou um progressivo alargamento no pico de transição de fase, diminuição na t1/2 e H. A pré-transição de fase só foi detectada até a concentração de 15% de DPPS em DPPC. Para 20% de DPPS e acima, observou-se uma segregação lateral de fase com a formação de possíveis microdomínios ricos em DPPS. A interação da AnxA5 com DPPC-lipossomos e DPPC:DPPS 10%-lipossomos resultou em uma redução nos valores de H (de 8,73 para 5,68 e 8,43 para 5,37 Kcal.mol-1, respectivamente). Quando a TNAP está presente nos proteolipossomos, este efeito é ainda maior. A AnxA5 incorporada em DPPC-proteolipossomos e DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos (razão molar) foi capazes de mediar o influxo de 45Ca2+ para dentro das vesículas (~ 800 nmol Ca2+) quando utilizados faixas de concentração de cálcio em níveis fisiológicos (~2 mM). A presença da TNAP nos proteolipossomos não afetou o influxo de Ca2+ mediado pela AnxA5. Entretanto, a presença da AnxA5 afetou significativamente os parâmetros cinéticos da TNAP para os diferentes substratos. Estudos com vesículas unilamelares gigantes (GUVs) também confirmaram a inserção funcional da AnxA5 em vesículas constituídos de dioleoil fosfatidilcolina (DOPC) e DOPC:DPPS 10% (razão molar). O principal efeito causado pela AnxA5 na morfologia das GUVs foi a perda de contraste óptico devido a formação de poros nas membranas das vesículas. Neste caso, a presença de DPPS não proporcionou mudanças significativas para a incorporação da AnxA5. TNAP quando inserida em GUVs provocou intensa flutuação e excesso de área das vesículas com formação de filamentos. A presença do DPPS provavelmente dificulta a inserção da TNAP à membrana das GUVs. Quando há microdomínios lipídicos heterogêneos na composição de GUVs compostas por DOPC:Colesterol:Esfingomielina (8:1:1) e DOPC:Colesterol:Esfingomielina:Gangliosídeo (7:1:1:1) (razão molar), a inserção da TNAP provocou uma maior segregação lateral de fase evidenciada por imagens com fluorescência. A presença da TNAP e AnxA5 em DPPC:DPPS 10%-proteolipossomos proporcionou mudanças significativas nas propriedades mecânicas visco-elásticas dos proteolipossomos detectadas por imagens de Microscopia de Força Atômica. Assim, no presente trabalho foi possível obter uma inédita metodologia para a formação de proteolipossomos contendo TNAP e AnxA5 concomitantemente, os quais apresentaram uma reconstituição funcional das proteínas, apresentando capacidade de captar Ca2+ para dentro das vesículas e habilidade de hidrolisar fosfosubstratos em sua superfície.