Cultivos de células animais visando a altas concentrações celulares: processo em perfusão e suplementação com aminoácidos.

• Ano de defesa: 2013
• Autor(a) principal: Costa, Bruno Labate Vale da
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Animal cells; BHK-21; Cell metabolism; Células animais; Drosophila melanogaster S2; Metabolismo celular; Perfusão; Perfusion; Spin-filter; Spinfilter
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-24122013-112802/

Células animais são alvo de pesquisas visando sua utilização como plataforma para a expressão de proteínas recombinantes, desde vacinas veterinárias até fatores de coagulação para hemofílicos. Exemplos incluem células de inseto Drosophila melanogaster S2 e células de mamífero BHK-21, que vêm sendo estudadas visando a sua utilização para a produção da glicoproteína do vírus da raiva. Independentemente da estratégia de cultivo utilizada, altas concentrações celulares são em geral associadas a uma maior produção da proteína de interesse. O objetivo deste trabalho foi o de investigar estratégias que possibilitariam o cultivo de células animais em altas concentrações celulares. Células de inseto Drosophila melanogaster S2 produtoras da glicoproteína do vírus da raiva foram cultivadas em frascos agitados a 100 rpm e 28, em meio livre de soro SF 900 II suplementado com os aminoácidos asparagina, cisteína, prolina e serina. A adição dos quatro aminoácidos no meio de cultura refletiu em um aumento da concentração celular máxima (XV MÁX) em 16%. Cisteína, quando adicionada isoladamente no meio de cultura, refletiu em uma velocidade específica máxima de crescimento celular (MÁX) 56% maior. Nessa condição, o fator de conversão glicose a célula (YX/GLC) foi 47% maior, indicando um metabolismo de glicose mais eficiente na geração de células. Esses resultados indicam que cisteína é provavelmente substrato limitante do cultivo de células S2AcGPV em meio SF 900 II. Já células de mamífero BHK-21 (C13), adaptadas ao crescimento em suspensão, foram cultivadas em processo de perfusão, processo contínuo em que há retenção celular, o que permite alcançar concentrações celulares mais altas que processos em batelada ou em modo contínuo sem retenção celular. Foi utilizado um biorreator do tipo tanque agitado com 1,5 L de volume de trabalho e spin-filter interno, com poro de diâmetro igual a 10 m, acoplado ao eixo do impelidor. Durante o cultivo, o pH foi controlado em 7,2, a agitação em 80 rpm, a temperatura em 37 e o oxigênio dissolvido em 50% da saturação com o ar. A concentração celular máxima alcançou 15,7 x 106 céls mL-1, muito superior à do cultivo em batelada (aproximadamente 5 x 106 céls mL-1). A viabilidade celular foi superior a 90% durante os 48 dias de cultivo. Na fase batelada do cultivo em perfusão, as velocidades de consumo de glicose (qGLC) e de glutamina (qGLN) foram 84% e 32% maiores, respectivamente, em relação às velocidades observadas no cultivo em batelada. Analogamente, as velocidades de produção de lactato (qLAC) e de amônio (qNH4) foram 78% e 102% maiores, respectivamente. Ainda, o coeficiente de manutenção celular não foi desprezível, e o consumo de glicose associado à manutenção celular foi de 83%. Esses dados indicam que a presença do spin-filter interno pode estar associada a estresse celular. Na perfusão, a concentração celular foi cerca de 3 vezes maior do que no cultivo contínuo sem reciclo de células. Provou-se que é possível cultivar células BHK-21 adaptadas a crescimento em suspensão em altas concentrações celulares em escala laboratorial, utilizando biorreator de bancada e spin-filter interno como sistema de retenção celular.