| Resumo: |
Aminoglicosídeos é uma classe de antibióticos caracterizado por conter açúcares aminados unidos por ligações glicosídicas a um anel aminociclitol central. Esses antibióticos são usados primariamente para tratamento de infecções causadas por bactérias aeróbicas gram-negativas. Sua ação consiste na inibição da síntese proteica, através da ligação na subunidade 30S do ribossomo bacteriano. Porém, infelizmente, clinicamente o uso dessas moléculas é limitado devido a otoxicidade e nefrotoxicidade. Os aminoglicosídeos incluem tobramicinas, amicacinas, canamicinas, estreptomicinas, paromicinas, neomicinas, gentamicinas e sisomicinas. A sisomicina e gentamicina possuem como anel central o 2-deoxistreptamina (2-DOS) e são altamente aminados e metilados. Assim, a rota biossintética dessas moléculas apresentam diversas enzimas que realizam tais decorações nos anéis, e que podem ser possíveis alvos em biotecnologia a fim de se obter novos derivados de aminoglicosídeos. Entretanto, para alcançar este propósito, é necessário primeiro decifrar os mecanismos moleculares das enzimas através da resolução de suas estruturas tridimensionais. Assim, os objetivos deste trabalho foi realizar a dissecção das enzimas específicas envolvidas na biossíntese dos antibióticos sisomicina e gentamicina. Para isso, foi utilizado métodos de expressão heteróloga de proteínas, cromatografia por afinidade e exclusão molecular e Cristalografia de Raio-X para determinação estrutural das proteínas alvo do projeto. Assim, foi obtido estruturas cristalinas das enzimas dependentes de piridoxal-5-fosfato: Sis5, GenB2, GenB3 e GenB4 em complexo binário com seus cofatores e complexo ternário com intermediários de biossíntese. Através dessas estruturas foi revelado detalhes a respeito da natureza das enzimas. Além das peculiaridades de cada uma que as possibilitam realizar diferentes modificações nos substratos. Adicionalmente, para a metiltransferase GenN foram obtidos complexos com seu substrato e outros análogos ou substratos alternativos. Esses complexos demonstraram a capacidade da enzima de metilar outros aminoglicosídeos, produzindo Canamicina metilada e Tobramicina metilada, gerando produtos naturais não naturais. Com a obtenção da estrutura tridimensional dessas enzimas e uma profunda análise estrutural foi possível realizar um estudo mais detalhado sobre mecanismo de catálise e a promiscuidade de tais enzimas, demonstrando seu potencial uso em biologia sintética para produção de derivados de aminoglicosídeos. |
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