Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: |
2024 |
Autor(a) principal: |
Michaliski, Lamonielli Faga |
Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
Tipo de documento: |
Tese
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Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
Idioma: |
por |
Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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Departamento: |
Não Informado pela instituição
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País: |
Não Informado pela instituição
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Palavras-chave em Português: |
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Link de acesso: |
https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75133/tde-02092024-164002/
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Resumo: |
Micro-organismos obtidos de ambientes isolados podem apresentar potencial metabólico bastante diferenciado, produzindo em meio de cultura substâncias bioativas. Este projeto objetivou investigar o metabolismo secundário de micro-organismos endofíticos e antárticos, visando a descoberta de produtos naturais bioativos. Uma linhagem de actinomiceto endofítico foi selecionada para cultivo em escala ampliada. A investigação química dos metabólitos secundários produzidos em cultura por essa linhagem levou ao isolamento de um policetídeo macrocíclico, que teve sua estrutura planar e configuração relativa determinada por experimentos de RMN e configuração absoluta parcial proposta pela análise do genoma desta linhagem bacteriana. O projeto também objetivou realizar a investigação da biossíntese de α-aminopironas, classe de substâncias bioativas incomuns produzidas apenas por fungos do gênero Aspergillus. O esqueleto das α-aminopironas indica serem estas de origem biossintética mista, do tipo PKS-NRPS. O genoma da linhagem selvagem de Aspergillus sp. DLM38 foi sequenciado. Análises de bioinformática possibilitaram selecionar dois biosynthetic gene clusters (BGCs) que podem ser responsáveis pela biossíntese das α-aminopironas produzidas por esta linhagem, o isopirofeno e a naftoquinonaimina. Utilizando ferramentas de engenharia genética para a inativação destes BGCs, objetivou-se verificar se na ausência destes a produção das α-aminopironas é interrompida. Mutantes foram construídos via recombinação homóloga e avaliados por PCR diagnóstica. Os perfis químicos produzidos em meio de cultura pela linhagem selvagem e pelas linhagens mutantes foram comparados por UPLC-HRMS com os padrões de isopirofeno e naftoquinonaimina previamente isolados. A produção das α-aminopironas alvo foi completamente abolida nas linhagens mutantes, indicando que os BGCs estudados estão envolvidos na biossíntese destes compostos por Aspergillus sp. DLM38. Em estágio BEPE vinculado a este projeto de doutorado direto, propusemos investigar mais profundamente a biossíntese de fomactinas pela linhagem fúngica marinha Biatriospora sp. CBMAI 1333. Após o sequenciamento do genoma completo (gDNA) da linhagem Biatriospora sp. CBMAI 1333, identificamos quatro diterpeno-ciclases (DTC) putativas e duas sintases de difosfato de geranilgeranila (GGPPS) que poderiam estar envolvidas na biossíntese das fomactinas. As quatro DTCs putativas foram expressas em Aspergillus nidulans juntamente com uma das duas GGPPS identificadas, para suplementar o precursor GGPP para as DTCs. A produção de metabólitos pelas linhagens transformantes foi investigada por análise de GC-MS, e quatro linhagens de transformantes, DTC1-4+GGPPS1 foram investigadas em larga escala. Os diterpenos produzidos por DTC1, DTC2 e DTC4 foram purificados, e a caracterização estrutural foi realizada por análises de RMN. O produto de DTC3 foi identificado por GC-MS. Além disso, um produto biossintético avançado do cluster DTC2 foi identificado por meio da expressão de suas enzimas adicionais de modificação, oxidorredutases. Os compostos identificados pertencem a família dos diterpenos pimaranos, sendo o produto biossintético avançado do cluster DTC2 nunca antes reportado em culturas fúngicas. |