Estudo do envolvimento da RNA helicase Sub2 na reação de splicing em Trypanosoma brucei

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Boralli, Camila Maria dos Santos
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Splicing; Trypanosoma brucei; Sub2
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-03102018-092702/

A excisão de sequencias intrônicas dos precursores de mRNAs é um passo crítico durante a expressão gênica eucariótica. Essa reação é catalisada pelo complexo macromolecular denominado spliceossomo, composto por partículas ribonucleoproteicas nucleares (U1, U2, U4/U6, U5 snRNPs), além de inúmeros fatores associados. Em tripanossomatídeos, os genes são transcritos em longas unidades policistrônicas e a reação de SL trans-splicing é requerida para geração de transcritos monocistrônicos maduros. O spliceossomo é uma maquinaria altamente dinâmica e parte das mudanças conformacionais ocorridas neste complexo é mediada por RNA helicases. A RNA helicase/ATPásica Sub2 (em mamífero, UAP56), cujas homólogas foram descritas como membros do complexo TREX (transcrição/exportação do RNA), é essencial na montagem do pré-spliceossomo, além de estudos sugerirem sua participação em outras etapas de montagem desse complexo. Em tripanossomatídeos, a função desta proteína no transporte de mRNA entre núcleo e citoplasma já foi descrita, entretanto, seu envolvimento na reação de splicing permanece indefinido. Neste trabalho, buscou-se estudar esse envolvimento através de técnicas de purificação em tandem e RNA de interferência. A purificação dos parceiros de interação da proteína somada à identificação por espectrometria de massas mostrou que TbSub2 co-purifica com proteínas envolvidas em múltiplas vias do metabolismo do parasito, incluindo proteínas e fatores relacionados ao processamento de mRNA. Além disso, essa proteína é essencial para os parasitos na forma procíclica e sanguínea e apresenta localização nuclear em ambas as linhagens. Análises por qPCR em tempo real e RT-PCR mostraram que o silenciamento de TbSub2 causa defeito na maquinaria de SL trans-splicing mas seu efeito no cis-splicing não é claro. Por fim, foi possível realizar a expressão heteróloga e purificação da proteína TbSub2 recombinante, bem como estudos para avaliar seu estado oligomérico e estabilidade. Dessa forma, foi constatado que essa proteína é estável em diferentes tampões e apresenta estados oligoméricos distintos nas técnicas empregadas nesse trabalho. O estudo aqui apresentado trouxe evidências da participação da proteína TbSub2 na reação de SL trans-splicing em ambas as linhagens, bem como em múltiplas vias do metabolismo do parasito na forma procíclica, contribuindo para uma elucidação das funções dessa proteína em tripanossomatídeos.