Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2018 |
| Autor(a) principal: |
Vieira, Paulo Cesar Gomes |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Dissertação
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-12122018-141016/
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Resumo: |
As serino-proteases autotransportadoras de Enterobacteriaceae (SPATE) constituem uma família de proteases secretadas pelo sistema de secreção do tipo V, cujos genes foram estudados em Escherichia coli intestinal e extra-intestinal. Sat é uma SPATE citotóxica de 107 kDa, cujo gene foi identificado pela primeira vez em UPEC isolada da urina de um paciente com pielonefrite. A maioria dos estudos envolvendo Sat foram realizados em células renais e da bexiga, embora seu gene seja encontrado em DAEC, EAEC e, mais recentemente, em amostras bacterianas isoladas de septicemia neonatal e meningite. Os objetivos deste trabalho foram: i) purificar Sat; ii) determinar a ação da Sat purificada em diferentes tipos celulares e iii) caracterizar o papel de Sat na infecção in vitro por EAEC. Desta foram, a presença de Sat nos sobrenadantes do cultivo das cepas EAEC CV323 e DEC/Sat, isoladas de diarreia, foi confirmada por LC-MS/MS. Sat foi purificada da cultura de DEC/Sat+ e utilizada para a obtenção de anticorpos anti-Sat em coelho. O efeito citotóxico de Sat purificada foi investigado em células derivadas do endotélio (HUVEC) e do sistema urinário (Y1, LLC-PK1 e HEK-293) e gastrointestinal (Caco-2). Os parâmetros citotóxicos analisados foram: o descolamento celular e alterações na morfologia, permeabilidade e metabolismo mitocondrial das células. Para investigar o papel de Sat na infecção por EAEC, células Y-1 foram infectadas com EAEC CV323 e DEC/Sat+ na presença ou ausência de PMSF (inibidor de serino-protease) e anticorpos anti-Sat. Os parâmetros de citotoxicidade analisados nas culturas infectadas foram descolamento celular e alteração na morfologia. Os resultados demonstraram que: i) Sat é secretada por EAEC CV323 e DEC/Sat+ e, em ambas as cepas, há duas mutações em resíduos de aminoácidos que não interferiram na atividade enzimática; ii) as células do endotélio são mais sensíveis à Sat do que as células derivadas do trato urinário, sendo a linhagem gastrointestinal a mais resistente; iii) Sat secretada por EAEC CV323 durante a infecção induziu intenso dano celular, o qual, em presença de anticorpos anti-Sat e PMSF foi reduzido em cerca de 80 a 90%, respectivamente. Este é o primeiro trabalho que demonstra a expressão de Sat pela EAEC e a ação da toxina em células endoteliais sugerindo que o papel de Sat possa ser mais amplo na patogenia do que o proposto até o momento. |
