Caracterização de novos mecanismos regulatórios e de resistência ao ferro em Chromobacterium violaceum

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Batista, Bianca Bontempi
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Chromobacterium violaceum; Família MarR; Fatores de transcrição; H-NS proteins; Homeostase de ferro; Iron homeostasis; MarR family; Proteínas H-NS; Quorum sensing; Sideróforos; Siderophores; Transcription factors
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-10102023-155258/

O ferro é um micronutriente essencial, necessário como cofator em diversas reações biológicas, mas seu excesso intracelular pode gerar danos. Em bactérias, a homeostase de ferro envolve sistemas regulatórios que controlam a captação, em limitação, e o efluxo e estocagem, em excesso, deste metal. Neste trabalho, identificamos e caracterizamos novos sistemas regulatórios e de resistência ao ferro em Chromobacterium violaceum, uma bactéria ambiental que ocasionalmente causa graves infecções em humanos. A identificação não enviesada de novos fatores de transcrição e sistemas de detoxificação de ferro foi realizada pela varredura de uma biblioteca de 10 mil mutantes de transposon. A varredura em placas PSA-CAS revelou 25 genes com inserção do transposon com alteração dos halos de sideróforos. Os genes mutados agrupam em diferentes categorias funcionais, sendo que seis deles foram estudados por codificar sistemas regulatórios. Mutação nula dos genes csrA (CV_2600) e CV_0635 não tiveram o mesmo fenótipo encontrado na varredura. Já inserções e mutação nula no sistema de dois componentes AirSR (CV_0536 e CV_0537) levaram ao aumento dos halos de sideróforo. A inserção e a mutação nula do regulador VitR levaram ao aumento dos halos de sideróforo e diminuição na produção de biofilme, violaceína e proteases. Determinamos que esses efeitos ocorreram exclusivamente devido à desrepressão de vioS no mutante vitR. VioS é um inibidor do regulador CviR do sistema de quorum sensing (QS) CviIR. De fato, inserção em cviR e mutação nula de cviI e cviR levaram ao aumento de halos de sideróforo. Ensaios de RNA-seq dos mutantes ΔcviI e ΔcviR revelaram que CviR regula conjuntos de genes dependentes e independentes de CviI. Processos clássicos dependentes de QS (violaceína, proteases e antibióticos) foram ativados em alta densidade celular por CviI e CviR. No entanto, genes relacionados à homeostase do ferro e outros processos foram regulados por CviR, mas não por CviI, sugerindo que CviR atua sem seu autoindutor canônico CviI. Nossos dados revelaram uma complexa cascata regulatória envolvendo o regulador VitR atuando upstream do sistema de QS para controlar a homeostase do ferro mediada por sideróforos em C. violaceum. A varredura da biblioteca de transposon em excesso de ferro revelou mutantes susceptíveis ao excesso de ferro com inserção do transposon em dezoito genes, sendo que dois sistemas regulatórios foram selecionados para caracterização. O primeiro sistema consiste do operon CV_3659-58-57 que codifica o fator de transcrição da família MarR CV_3659 e a citocromo bd oxidase CV_3658-57. Demonstramos que o regulador CV_3659 reprime a expressão de seu operon e que a citocromo bd oxidase é necessária para a resistência de C. violaceum a diferentes metais (zinco e ferro), ao sulfeto e ao estresse oxidativo e nitrosativo. Por fim, caracterizamos duas proteínas H-NS de C. violaceum. RNAseq revelou que as H-NS CV_1363 e CV_1243 silenciam a expressão de diversos genes em C. violaceum, com destaque para genes presentes em ilhas de patogenicidade. Como CV_1363 silencia a expressão de CV_1243, os efeitos de CV_1243 em fenótipos e regulação gênica só foram evidenciados com mutação de ambas H-NS. Caracterização fenotípica revelou que as H-NS de C. violaceum estão envolvidas na produção de violaceína, motilidade do tipo swimming, na homeostase de ferro e na resistência ao pH ácido e a alta osmolaridade. Em conclusão, C. violaceum utiliza diversos sistemas regulatórios para controlar a homeostase de ferro, tanto a captação mediada por sideróforos quanto a tolerância ao excesso de ferro.