Efeito da densidade populacional sobre a frequência de mutantes

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Fonseca, Luísa Andrea Villanueva da
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Escherichia coli; Bacterial genetics; Frequência de mutantes; Genética bacteriana; Microbiologia; Microbiology; Mutant frequency; PHO regulon; Regulon PHO
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-13102022-172516/

Fósforo é um elemento essencial para vários processos celulares, geralmente assimilado na forma de fosfato inorgânico (Pi). A concentração de Pi no ambiente é variável, levando os micro-organismos a se adaptarem para melhor captar, metabolizar e utilizar este nutriente. Em E. coli, mais de 40 genes formam o regulon PHO, o principal sistema responsável pela captação de Pi. Estes são regulados pela concentração extracelular de Pi, percebida pelo transportador PstSCAB-PhoU. Mutações em qualquer um dos genes deste transportador levam a expressão constitutiva do regulon. Bactérias contendo mutações PHO-constitutivas (MPCs) são inibidas na presença de bactérias selvagens em meio contendo glicerol-2-fosfato (G2P) como fonte de carbono devido à competição pelo glicerol oriundo da quebra do G2P numa \"tragédia dos comuns\"; assim, a frequência de MPCs depende da concentração de bactérias no meio seletivo. Portanto, este trabalho tem dois objetivos: identificar e caracterizar possíveis efeitos da densidade sobre a frequência de mutantes (FM) em dois sistemas mutacionais (phn+ e lacc) e verificar a existência de MPCs dentre isolados naturais de E. coli e in silico. Para isto, diferentes densidades celulares foram semeadas sobre placas de meio mínimo seletivo contendo a limitação nutricional adequada e a FM foi avaliada após 96 h de incubação. Ambos os sistemas estudados apresentaram aumento da FM de forma inversamente relacionada a densidade bacteriana na placa. A FM quando 5 × 107 bactérias selvagens phn- são plaqueadas é 13 x maior do que a de 109 - e para mutantes lacc, esta diferença chega a 23 x entre as concentrações 106 e 108. A adição de bactérias removedoras elimina a relação inversamente proporcional vista nas placas não tratadas. Contudo, o número de removedoras na placa pode exercer alguma inibição sobre o surgimento de mutantes, como observado em MPCs; desta forma, as removedoras foram inoculadas sobre membranas de celulose, incubadas por 48 h e removidas antes do semeio das bactérias selvagens. O tratamento com membranas reduz as FMs em relação às placas não tratadas (reduções de até 86% no sistema phn e 69% em lac) porém ainda existe variação na frequência de mutantes em relação a densidade - 8,7 x para lacc e 3,3 x para phn+. Todavia, foi identificado um crescimento residual em placas tratadas com membranas semeadas com menos células. Foi ainda observado que isolados phn+ derivados de MG1655 tem seu crescimento inibido na presença de removedoras a 44ºC e que lsrK pode interferir na diminuição da FM em mutantes lacc. A triagem de MPCs em isolados naturais de amostras de água do córrego Pirajuçara resultou em 16 potenciais MPCs - alguns contendo deleções e inserções em genes do operon pst. In silico, foi identificado um mutante pstB- dentre 2303 genomas de E. coli disponíveis no GenBank. Estes resultados sugerem que para a identificação mais precisa de variações na frequência de mutantes, deve se analisar densidades onde não haja crescimento residual na placa; e que MPCs podem estar presentes na natureza em ambientes onde, em teoria, não há seleção para estas mutações.