Modificação de superfícies para o uso em cultura de células

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Araujo, Wagner Wlysses Rodrigues de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: células CHO; CHO cell; DLC; Microfabricação.; Microfabrication.; Modificação de Superfícies; PDMS; SU-8; Surface modification
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/43/43134/tde-24032015-101105/

O projeto de novos materiais para aplicações tecnológicas em biomateriais e bioengenharia é altamente dependente de como as células aderem à superfície de um material. A adesão e crescimento em biomateriais depende de propriedades do substrato, tais como molhabilidade da superfície, a topografia e a composição química de superfície. O objetivo deste estudo foi investigar as interações de diversos materiais com culturas celulares de células epitelial CHO (Ovário de Hamster Chinês). Os materiais utilizados foram SU-8 2005 (elétron-resiste, Microchem), PDMS (Poli (dimetil siloxano), Down Corning), DLC (Diamond-like Carbon) e vidro foi utilizado como referência. Superfícies de vidro, SU-8, PDMS e DLC lisas (planas) e isentas de modificação ou tratamento específico foram avaliadas quanto ao cultivo de células CHO. Valores médios dos fatores de forma (Ff) de 450 células foram calculados para cada uma das culturas realizadas sobre os 4 substratos. Foram obtidos Ff próximos a 0,52 para o vidro, o SU-8 liso e o DLC, demonstrando um bom espraiamento das células nessas superfícies. A superfície de PDMS apresentou valor unitário para o fator de forma (Ff), que está relacionado a um baixo espraiamento das células. A energia de superfície (ES) obtida para o PDMS é compatível com o resultado de fator de forma (Ff), uma vez que o menor valor para ES é coerente com a baixa adesão celular, o que gerou células com elevado fator de forma (Ff). O SU-8 foi modificado por implantação iônica com uma dose de 1,2x1016 átomos/cm2 e a energia de implantação foi de 8 keV, como referência foi utilizada uma superfície lisa de SU-8 sem implantação. Os resultados mostraram que o número de células vivas por unidade de área foi superior na superfície de SU-8 com prata implantada, mostrando o bom desempenho da cultura nesse substrato. As superfícies de DLC modificadas por tratamento com plasma de oxigênio (DLC-O) e com plasma de hexafluoreto de enxofre (DLC-F) foram utilizadas para cultura celular, os resultados de três experimentos independentes de contagem de número de núcleos (marcados com DAPI) por unidade de área confirmaram os resultados obtidos através do teste de viabilidade (marcados com trypan blue). A superfície de DLC-O, apresentou um maior número de núcleos por unidade de área, quando comparado à superfície DLC-F, da mesma forma que nos resultados obtidos pelo teste de viabilidade. As energias de superfície para as amostras de DLC-F e DLC-O indicaram que a superfície DLC-O é mais hidrofílica do que a superfície DLC-F, que está coerente com o que é conhecido da literatura e com os resultados obtidos em nosso trabalho. Cultura de células CHO foram realizadas em superfícies litografadas com estruturas hexagonais periódicas com o parâmetro 2R (diâmetro do círculo inscrito) sendo 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. Estas superfícies foram caracterizadas por microscopia óptica de fluorescência com relação ao número de núcleos (marcados com o fluoróforo DAPI) por unidade de área, isto é, núcleos/mm2. Obteve-se histogramas com o número médio de núcleos por mm2 em três experimentos independentes, onde o número núcleos/mm2 foi consideravelmente maior para 80 µm. As superfícies contendo cavidades periódicas de 12 µm e 30 µm apresentaram dificuldade para as células CHO aderirem à superfície. Em uma outra etapa realizou-se culturas celulares em triplicata dos substratos com as superfícies 12 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As células em cada uma das superfícies foram analisadas por microscopia óptica (MO) para avaliação da viabilidade celular, utilizando marcador trypan blue. Obteve-se histogramas com os valores médios para o número de células vivas/mm2 para as culturas celulares que corrobora os resultados obtidos no histograma da cultura celular que tiveram os núcleos marcados pelo fluoróforo DAPI. Assim, fica confirmado o melhor desempenho da cultura celular no substrato 80 µm que apresentou o maior número de células vivas/mm2 As micrografias obtidas através de marcação por DAPI foram analisadas através da função de correlação com intuito de se entender como as células estavam organizadas. Isso foi feito para cada uma das superfícies litografadas, 12 µm, 30 µm, 80 µm, 280 µm, 560 µm e também em SU-8 liso. As superfícies dos substratos 80 µm apresentaram os menores valores de distâncias para primeiros e segundos vizinhos, ou seja, as células estão mais próximas umas das outras. As demais superfícies tendem a separar mais as células. Obteve-se também os valores de raio de aglomerado (rc), distância entre os aglomerados (dc) e o número de primeiros vizinhos (Np) através do ajuste da função de correlação. A análise de correlação mostrou com clareza o que não era evidenciado apenas visualizando-se as imagens. Ela mostra que as células, mesmo em SU-8 liso tem a forte tendência de formar aglomerados de células com raio de aproximadamente 45 µm. No caso de substratos lisos, células CHO apresentaram a melhor adesão na superfície do SU-8, seguido do DLC, enquanto que o PDMS foi a pior situação, devido à baixa molhabilidade do material. No caso de superfícies com microestrutura, SU-8 contendo microcavidades hexagonais de 12 e 30 µm mostraram ser as situações mais adversas para o crescimento de células CHO, provavelmente por causa da topografia das cavidades serem de menor tamanho quando comparadas ao tamanho das células CHO. Em vez disso, SU-8, contendo microcavidades hexagonais de 80 µm foi a superfície mais favorável para o crescimento de células CHO.