Estudos de duas enzimas da bactéria Xylella fastidiosa, GumC e GumK, envolvidas na síntese da goma fastidiana

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Pieri, Celina de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: GumC; GumC e GumK; GumK; Xylella fastidiosa
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-06122013-113617/

A bactéria XvIella fastidiosa tem sido associada com doenças economicamente importantes como a clorose variegada de citros (CVC) em citros no Brasil e a doença de Pierce em videiras nos Estados Unidos (Hopkins, 1989 e Purcell et al., 1997). A importância econômica da indústria de citricultura no Brasil e o grande prejuízo causado pela CVC em pomares brasileiros têm resultado em um extensivo programa de pesquisa que começou com o sequenciamento do genoma completo da X Fastidiosa (Simpson., et ai 2000). A bactéria é transmitida por insetos conhecidos como \"cigarrinhas\" que se alimentam da seiva do xilema. O principal efeito da doença é o surgimento de manchas amarelas nas folhas que progridem para toda a extensão levando-a à necrose. Os frutos de plantas infectadas são pequenos (representando 1/3 do tamanho de um fruto normal), apresentam casca dura e são impróprios para o consumo. Esta bactéria apresenta em seu genoma um Operon contendo 9 genes (B,C,D,E,F,H,J,K,M) responsáveis pela biossíntese do exopolissacarídeo denominado goma fastidiana, que pode estar envolvido na sua patogenicidade. No presente trabalho temos como objetivo estudar as enzimas GUMC, que provavelmente está envolvida na etapa de polimerização e/ou secreção do polissacarídeo formado através da membrana da bactéria, e GUMK, uma glucuronosiltransferase ou glicosiltransferase IV, que adiciona uma molécula de ácido glicurônico à molécula da manose para a formação do tetrassacarídeo (manose-α-1,3- glucose-β-1,4-glucose-P-P-polyprenol). O gene gumC foi clonado no vetor de expressão pMALc-2x, a proteína de fusão GUMC-MBP foi expressa com uma massa molecular calculada de 98kDa e foi purificada através de coluna de afinidade. A proteína de fusão foi caracterizada pela reação com o anticorpo anti-MBP por imunoblotting. Através da técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (EDL), foram realizados estudos de agregação com a proteína de fusão GUMC-MBP. Ensaios de cristalização foram realizados e microcristais da proteína de fusão GUMC-MBP foram obtidos. Após a clivagem da proteína de fusão com a enzima Factor Xa, a enzima GUMC foi separada através da cromatografia de troca aniônica. A massa molecular da enzima foi determinada através da cromatografia de filtração em gel, superose 12, eluindo na forma monomérica com 53kDa. A proteína GUMC foi caracterizada pela reação com o anticorpo anti-GUMC-MBP (produzido em camundongos) através da técnica de imonublotting. A enzima também foi caracterizada através da técnica do dicroísmo circular (CD), apresentando um espectro característico de estrutura secundária enovelada, composta predominantemente por α-hélices. Foram realizadas 9 construções para a retirada das regiões transmembrânicas das regiões 5 e 3° do gene gumC (1 construção para o vetor de expressão pET29b e 8 para o vetor pMALc-2x). Em uma das construções, a proteína de fusão modificada GUMC-MBP 5C foi expressa no vetor de expressão pMALc-2x e foi purificada em coluna de afinidade. A proteína de fusão modificada GUMCMBP foi clivada com a enzima Factor Xa. Estudos de agregação molecular das proteínas de fusão GUMC-MBP e GUMC-MBP modificada C5 e das enzimas GUMC e GUMCC5 modificada poderão ser realizados futuramente. O gene gumK foi clonado no vetor pMAc-2x, a proteína de fusão GUMK-MBP foi expressa, com uma massa molecular calculada de 86kDa e foi purificada em coluna de afinidade. A proteína de fusão foi caracterizada por imunoblotting e medidas de dicroísmo circular foram realizadas. Após clivagem com o Factor Xa, a enzima GUMK foi purificada através da cromatografia de troca catiônica. Ensaios de cristalização foram realizados onde microcristais e cristais em forma de agulha foram obtidos. Futuramente, estudos estruturais e funcionais destas enzimas poderão trazer informações sobre a patogenicidade da X fastidiosa, assim como possibilitar o desenvolvimento de inibidores específicos