Produção e purificação da glicocerebrosidase humana recombinante expressa por célula CHO em meio livre de soro fetal bovino

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Cassundé, Bruna Cristine Fernandes
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Célula de ovário de hamster chinês (CHO); Chinese hamster ovary cell (CHO); Doença de Gaucher; Gaucher Disease; Glicocerebrosidase; Glucocerebrosidase; Meio de cultura celular livre de soro; Protein purification; Purificação de proteína; Serum free medium
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-09032017-153808/

A produção de proteínas recombinantes, principalmente para uso farmacêutico, tem sido intensamente estudada, juntamente com suas propriedades físico-químicas, o que possibilita uma melhor escolha da técnica de purificação, e assim, evitar perdas no rendimento e custos elevados. A glicocerebrosidase (GCR) é uma enzima lisossomal, e sua deficiência ocasiona um distúrbio autossômico recessivo denominado doença de Gaucher. Atualmente o tratamento para essa patologia é por meio da Terapia de Reposição Enzimática (TRE), a qual tem sido realizada com grande êxito. Tendo em vista fornecer dados que possam auxiliar na redução do número de etapas cromatográficas no processo de downstream, este trabalho teve como objetivo, a purificação da GCR expressa por células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em meio livre de soro fetal bovino (SFB). Para se alcançar tais resultados, realizou-se o cultivo das células CHO-GCR em meio quimicamente definido livre de SFB (CHO-S-SFM II). Foram realizadas três técnicas cromatográficas (troca iônica, interação hidrofóbica e afinidade), com base em suas propriedades físico-químicas. E para o ensaio da atividade enzimática, foi utilizado o substrato fluorogênico 4-Methylumbeliferyl β-D-glucopyranoside (4MU-G). As células CHO-GCR cultivadas em meio CHO-S-SFM II, apresentando viabilidade maior que 95%, e produção da GCR ativa, durante todo o período de cultivo. Os protocolos aplicados para a purificação da GCR, não apresentaram resultados significativos. Com o volume não retido após cromatografia por interação hidrofóbica, se estimou os valores de KM 2,13 e VMAX 0,0295 UFR/h para as constantes cinéticas da GCR. A diálise no processo de purificação mostrou ser uma etapa necessária para a atividade enzimática da GCR. No cultivo das células CHO-GCR para a formação do banco de trabalho, nos meios RPMI 1640 e α-MEM, ambos com a adição de 10% SFB, não houve diferença significativa no crescimento entre eles, e apresentaram 100% de viabilidade durante todo o período de cultivo. Porém, ao analisar de forma isolada a fase exponencial de cada curva, notou-se que às células cultivadas no meio RPMI 1640, apresentaram taxa de crescimento superior, às cultivadas em meio α-MEM. Concluiu-se que a expressão da GCR em meio livre de SFB, proporciona amostras menos complexas, em relação aos meios de cultura que necessitam de suplementação com SFB, o que pode reduzir o número de etapas cromatográficas, melhorando o rendimento e a redução da perda da atividade da GCR. O meio basal RPMI 1640 com a adição de SFB foi uma alternativa satisfatória para o cultivo das células CHO-GCR. Este estudo forneceu dados que podem contribuir para a melhoria do processo de purificação da GCR. Novas pesquisas podem ser desenvolvidas a fim de melhorar o processo de purificação da GCR.