Metabolismo de fucose, alpha-L-fucosidases e fucosiltransferases: Caracterização enzimática, mecanismo de catálise e papel fisiológico.

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Perrella, Natalia Nappi
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Aranha; Catálise; Catalysis; Fucose; Fucosidase; Glicosidases; Glycosidases; Spider
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-04122018-140405/

Os carboidratos são moléculas diversas e complexas que são empregadas por organismos vivos em funções biológicas, como eventos energéticos, estruturais e de sinalização. L-Fucose é um monossacarídeo presente em diversos grupos biológicos, como mamíferos, insetos e plantas. Umas das modificações póstraducionais mais conhecidas contendo L-Fucose são os antígenos do sistema sanguíneo ABO e o leite humano. Alterações no padrão de fucosilação estão relacionadas a patologias como câncer e fucosidose. Essas alterações estão relacionadas ao balanço entre as atividades de α-L-fucosidases e fucosiltransferases. As -L-fucosidases são glicosídeo hidrolases que catalisam a hidrólise de ligações entre resíduos de L-Fucose ligados a outras moléculas. Fucosiltransferases são glicosiltransferases que transferem L-Fucose de GDPfucose para um substrato receptor específico. Embora a importância do metabolismo da fucose, existem poucas informações sobre este assunto em Arthropoda. A literatura indica que fucose, α-L-fucosidases e fucosiltransferases estão envolvidas na interação parasita-hospedeiro em carrapatos, sugerindo que o metabolismo da fucose é essencial para Arachnida. Nosso objetivo foi estudar o metabolismo de fucose em duas espécies de Arachnida: a aranha Nephilingis cruentata e o carrapato Amblyomma sculptum. Ele foi realizado através da caracterização das fucosidases nativas e recombinantes, estrutura e análise in silico, mutagênese sitio-dirigida, padrão de expressão, especificidade e efeito nas células tumorais. Além disso, analisamos as sequências de fucosiltransferases e a expressão por qPCR. As enzimas envolvidas em caminhos metabólicos de fucose também foram investigadas. NcFuc e AsFuc têm um pH ótimo de 5, são inibidas por fucose e fuconojirimicina e apresentam processo de oligomerização dependente de pH. Nós produzimos com sucesso as formas recombinantes dessas enzimas, e elas apresentam as mesmas propriedades cinéticas das formas nativas. A hidrólise de substratos naturais por NcFucr e AsFucr sugerem especificidades diferentes, e ambas conseguiram remover resíduos de fucose de celulares tumorais, reduzindo a invasão celular. Além disso, elas catalisaram reações de transfucosilação. A produção recombinante permitiu a identificação dos resíduos D214 e E59 como díade catalítica em NcFuc. As análises filogenéticas, os dados cinéticos, a modelagem molecular e a especificidade sugerem que os sítios ativos das α-Lfucosidases são diferentes em cada espécie de Arachnida e indicaram que o significado fisiológico da remoção de fucose é diferente entre os organismos. Os ensaios de qPCR evidenciaram que, embora as α-L-fucosidases possam ser enzimas lisossômicas, elas são principalmente expressas no sistema digestório em Arachnida e estão envolvidas na digestão. Representantes de todas as famílias conhecidas de fucosiltransferases foram identificados nos dados do transcriptoma de aranha. No entanto, POFUT1 também foi identificado no nível proteômico e sua análise de expressão indicou uma maior expressão no MG. Isso pode estar relacionado à regeneração de células após a secreção de enzimas digestivas. A análise transcriptômica e proteômica indica que o Arachnida usa vias salvage e de novo para a síntese de fucose. Considerando todos os dados obtidos, concluímos 11 que o metabolismo da fucose está relacionado à digestão em Arachnida, uma vez que eles podem obter a fucose da dieta devido à presença de α-L-fucosidases muito ativas.