Expressão, purificação e caracterização do domínio GOLD da proteína TMED 1 humana

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Mota, Danielly Christine Adriani Maia
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Biofísica; Biophysics; Caminho de secreção inicial; Early secretory pathway; Família p24; P24 family; Protein secretion; Secreção de proteínas; TMED
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59135/tde-16032021-150930/

As proteínas TMEDs são proteínas transmembranares presentes em eucariotos em todos os subcompartimentos da via secretora inicial, ou seja, o retículo endoplasmático (RE), o Golgi e o compartimento intermediário. Embora essenciais durante o transporte bidirecional entre o RE e o Golgi, as TMEDs ainda carecem de informações sobre sua estrutura, estado oligomérico e de suas interações com a carga de transporte. Pela primeira vez, é descrita a expressão heteróloga, a caracterização biofísica e a estrutura tridimensional em alta resolução do domínio GOLD da proteína TMED 1 humana. A proteína recombinante foi purificada em duas etapas cromatográficas, apresentando rendimento e pureza que permitiram os estudos biofísicos. A análise dos dados de dicroísmo circular (CD) mostrou que, após a purificação, a proteína se encontrava enovelada e que a sua estrutura secundária era predominantemente de folhas β (~44%). A desnaturação química da estrutura secundária foi monitorada por CD na região do ultravioleta distante. A proteína apresentou-se quimicamente estável, e a curva de desnaturação segue um perfil do tipo sigmoidal (cooperativo) com uma concentração de meia transição de aproximadamente 2,8 M de uréia. A espectroscopia de fluorescência intrínseca das tirosinas foi também utilizada para avaliar a estabilidade na presença de ureia, resultando em uma transição que ocorreu em torno de 1,2 M. Do ponto de vista da estabilidade térmica, a proteína se apresentou com elevada estabilidade com temperatura de meio da transição de cerca de 60°C e não segue um modelo de transição dois estados, indicando uma provável dissociação de dímero em monômeros em estruturas desenoveladas. Os dados de Fluorimetria diferencial de varredura (DSF) mostraram que a força iônica é importante para a estabilidade estrutural do domínio GOLD. A proteína foi cristalizada com sucesso e sua estrutura determinada em uma resolução de 1,7 Å. A estrutura 3D mostrou uma organização estrutural tradicional dos domínios TMED GOLD, formado por um sanduíche-β composto por duas folhas β antiparalelas de quatro fitas conectadas por uma ligação dissulfeto. A curvatura dessas folhas-β define visualmente dois diferentes \"lados\" na organização conformacional, denominados côncavo (formada por β2, β7, β4 e β5) e convexo (formados por β6, β3, β8 e β1). Usamos a estrutura para realizar simulações de dinâmica molecular e o dímero apresentou-se energeticamente favorável e estável durante o tempo de simulação. A dimerização se apresentou favorecida por ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas e interações π-π. Os estudos para avaliar a formação de oligômeros em relação à concentração e à força iônica sugerem que a formação dos dímeros depende de ambos os fatores. Neste trabalho, propomos um modelo de ancoragem do dímero à membrana baseado na carga eletrostática superficial da proteína. Em tal modelo, o dímero se mostra orientado com seu lado convexo para o citosol, o que está de acordo com o modelo in vivo proposto em outros trabalhos e que permitiria a interação com o receptor ST2. O fato das membranas do complexo de Golgi e do RE serem enriquecidas em lipídeos carregados negativamente confere potencial impacto funcional à orientação proposta para o dímero.