Estudo das condições de cultivo de Escherichia coli para a produção da nuclease Cas9, utilizada em sistemas de edição de genoma CRISPR-Cas9.

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Carmignotto, Gabriela Pannunzio
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Batch mode; Bioprocessos; Biotecnologia; Cas9 protein; CRISPR-Cas9; Defined medium; Escherichia coli; Proteínas recombinantes; Reatores bioquímicos
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/3/3137/tde-31052021-094248/

A técnica CRISPR-Cas9 é uma ferramenta que vem sendo amplamente estudada na edição de genomas. Consiste em um complexo formado por uma nuclease chamada Cas9, que tem a função de cortar o DNA, e em um RNA guia (gRNA), que contém a sequência de reconhecimento do local de corte para a edição. A técnica CRISPR-Cas9 vem ganhando destaque para sua aplicação como ferramenta de biologia molecular e no tratamento de doenças, o que potencializa o uso da proteína Cas9 como biofármaco. Embora amplamente empregada, poucos são os estudos encontrados sobre a produção da proteína recombinante Cas9, de 158 kDa, derivada de Streptococcus pyogenes. Neste contexto, este trabalho tevecomo objetivo realizar um estudo sistemático da produção da proteína Cas9 contendo uma cauda de histidina em meio de cultura complexo e meio definido, empregando o vetor pET28b-Cas9His e duas cepas de E. coli: BL21(DE3) e BL21(DE3) Rosetta. Os resultados mostraram que a expressão da proteína Cas9 foi maior em E. coli BL21(DE3), enquanto que apenas traços da proteína Cas9 foram detectados na Rosetta, resultado do baixo nível de mRNA. O crescimento celular daE. coli BL21(DE3) e a expressão da proteína foram avaliados em meio complexo (LB) e meio definido (HDF) em frascos. A melhor condição de indução para a expressão da proteína Cas9 ocorreu em meio definido HDF, com adição de IPTG e temperatura de indução de 30ºC, em um intervalo de tempo de 8h, obtendo-se a concentração final de 96,4 mg de Cas9/L de cultivo. Ao empregar biorreator operado em modo batelada com meio definido HDF, a concentração celular, a velocidade específica máxima de crescimento e o fator de conversão de substrato em biomassa obtidos foram 5,6 g/L, 0,53 h-1 e 0,55, respectivamente. A concentração de proteína obtida em biorreator foi de 420,1 mg de Cas9/L de cultivo com 6h de indução. Este trabalho possibilitou produzir a proteína Cas9 de forma eficiente ao empregar-se a linhagem E. coli BL21(DE3) em biorreator usando meio definido HDF, com potencial para melhorias adicionais que poderiam facilitar a produção em larga-escala.