Caracterização estrutural e funcional de três enzimas com potencial uso biotecnológico da rota biossintética D-manose/L-galactose do ácido L-ascórbico de Myrciaria dubia \"camu-camu\"

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Santillan, Jhon Antoni Vargas
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Myrciaria dubia "camu-camu."; Biossíntese de vitamina C; Biosynthesis of vitamin C; Cinética enzimática; Crystallographic structure; Enzymatic kinetics; Espinafre; Estrutura cristalográfica; Spinafre
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76133/tde-30032023-113047/

Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh, conhecida como camu-camu ou araçá dagua, é uma fruta nativa da Amazônia, caracterizada por seu alto teor de L-Ácido Ascórbico (Vitamina C ou AsA). Devido a esta propriedade, as enzimas que participam da biossíntese de AsA poderiam ter potenciais aplicações biotecnológicos para a produção artificial de AsA. No entanto, a biologia estrutural das enzimas envolvidas tem sido bem pouco explorada. Aqui, descrevemos as propriedades biofísicas, funcionais e estruturais para três enzimas da via D-manose/L-galactose (Smirnoff & Wheeler). As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. GDP-D-manose-3,5-epimerase (MdGME), que catalisa uma dupla epímerização da GDP-manose para produzir GDP-L-galactose e GDP-L-gulose, provou ser um dímero em solução, suas estruturas cristalográficas foram resolvidas complexadas, sua forma apo (2,5 Å, ligada a NAD+) e holo (1.25 Å ligada a NAD+/substrato/produto). A L-galactose desidrogenase (MdGDH) e L-galactono-1,4lactona desidrogenase (MdGalDH) provaram ser monoméricas em solução. MdGDH apresentou uma atividade catalítica com um Km de 0,128 mM e pH ótimo de 7. Demostramos que a inibição por AsA em MdGDH é devido a mudanças no pH e não necessariamente por uma inibição competitiva pelo sítio ativo como foi reportada para a enzima homóloga de espinafre (SoGDH). A estrutura cristalográfica de SoGDH foi resolvida a 1,4 e 1,75 Å em suas formas apo e holo (ligado a NAD+), respectivamente. Finalmente a MdGalDH apresentou uma atividade catalítica com um Km de 0,044 mM e pH ótimo de 8 e apresentou uma inibição pelo próprio substrato. A estrutura cristalográfica foi resolvida a 2,1 Å. O presente trabalho contribui para uma compreensão mais amplo das relações estrutura-função das enzimas envolvidas na síntese da vitamina C.