Produção e caracterização da protease papalisina de Leptospira interrogans

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Courrol, Daniella dos Santos
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Leptospira; pappalysin-1 domain protein; atividade proteolítica; coagulação; coagulation; complement system; extracellular matrix; leptolisina; leptolysin; matriz extracellular; proteolytic activity; sistema complemento
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42132/tde-14092023-162932/

Espécies patogênicas de Leptospira são extremamente eficientes quanto à disseminação e propagação no hospedeiro, fato atribuído à capacidade que possuem de escapar da ação do sistema complemento, primeira linha de defesa da resposta imune inata, e também à capacidade de degradar componentes da matriz extracelular e do plasma humano. A secreção de proteases que inativam proteínas do hospedeiro é uma importante ferramenta utilizada por diversos microrganismos durante o processo de colonização. Os mecanismos subjacentes ao dano tecidual causado por leptospiras patogênicas ainda são pouco conhecidos. Assim como outras bactérias, leptospiras atravessam barreiras epiteliais e endoteliais para ter acesso aos órgãos. Adesão e degradação de componentes da matriz extracelular, principalmente da membrana basal, são certamente necessárias para invasão. Recentemente, nosso grupo avaliou a atividade proteolítica de proteínas secretadas por leptospiras, e uma análise do exoproteoma dessas bactérias permitiu a identificação de algumas proteases, dentre as quais a metaloprotease pappalysin-1 domain protein, à qual denominamos leptolisina. Neste projeto produzimos e caracterizamos funcionalmente a leptolisina de L. interrogans visando ampliar o conhecimento sobre essa metaloprotease de Leptospira nos processos de invasão e evasão imune. Análises in silico mostraram que esta protease pertence à categoria das short pappalysins, também encontradas em outras bactérias. A leptolisina está presente em todas as espécies de Leptospira analisadas, mas é mais conservada entre as espécies patogênicas do subclado P1. Uma caracterização bioquímica preliminar da atividade proteolítica desta protease foi realizada usando peptídeos FRET (Free Ressonance Energy Transfer). A enzima exibiu atividade máxima em pH 8,0 e 37oC, foi ativa na presença de diferentes sais e fortemente inibida por EDTA e 1,10-fenantrolina. Apresentou acentuada preferência por resíduos de arginina na posição P1. A ação proteolítica da leptolisina recombinante sobre moléculas do hospedeiro foi também avaliada in vitro e in vivo. A metaloprotease apresentou atividade sobre proteínas da matriz extracelular (proteoglicanas e fibronectina), moléculas da cascata de coagulação (fibrinogênio e trombina) e proteínas efetoras do sistema complemento humano (C2 a C9). Em um modelo de inoculação da proteína em pele dorsal de camundongos, observaram-se hemorragias e degradação de fibronectina extraída da pele. No que diz respeito aos impactos produzidos pela protease na coagulação, plasma humano tratado com doses elevadas da proteína deixou de coagular. Análises da microcirculação por microscopia intravital (modelo do músculo cremaster) apontaram um aumento no número de leucócitos rolantes na presença de leptolisina, e observou-se agregação leucocitária dependente de tempo. Uma cepa nocaute de leptolisina (&#916lic13434) foi produzida e caracterizada. Esta cepa apresentou menor sobrevivência em soro humano normal (SHN), comparada à cepa selvagem. No entanto, em um modelo de infecção epicutânea em hamsters, não se observou atenuação da virulência com a cepa nocaute, embora a carga bacteriana nos rins destes animais tenha sido inferior àquela observada nos animais inoculados com a cepa selvagem. Por fim, dados com soros de pacientes com leptospirose são sugestivos de que há produção de leptolisina durante infecções naturais por leptospiras patogênicas. A caracterização de toxinas, seus alvos e mecanismos de ação podem auxiliar no desenvolvimento de estratégias para combater a leptospirose.