Análises genéticas em sistemas microfabricados

• Ano de defesa: 2010
• Autor(a) principal: Duarte, Gabriela Rodrigues Mendes
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Análises genéticas; Diagnósticos de baixo custo; Genetic analysis; Low-cost diagnostics; Micro-total analysis system; Microchip de PT; Microssistemas de análises totais; Toner-based devices
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/75/75132/tde-04102010-145000/

A produção de microssistemas de análises totais (µTAS) tem sido objeto de esforços intensos pela comunidade científica. A necessidade de produção de uma plataforma que realize extração, amplificação e separação de DNA--um verdadeiro \"lab on a chip\"--é impulsionada pelas vantagens associadas com as análises em plataformas miniaturizadas. Esta Tese foca no desenvolvimento de métodos para análises de DNA em dispositivos microfluídicos que podem ser associados em µTAS. Inicialmente, foi feito o desenvolvimento de um novo método de extração em fase sólida em que a eficiência de extração depende da manipulação magnética das partículas e não do fluxo da solução através da fase sólida. A utilidade desta técnica em isolar DNA puro de alta qualidade (amplificável) a partir de uma amostra biológica complexa foi demonstrada através da purificação de DNA a partir de sangue total e a subsequente amplificação do fragmento do gene β-globina. A técnica descrita é rápida, simples e eficiente, permitindo uma recuperação de mais de 60% de DNA a partir de 600 nL de sangue em concentração suficiente para amplificação via reação em cadeia da polimerase (PCR). Após o desenvolvimento da extração dinâmica de DNA em fase sólida (dSPE) em microchip de vidro, o método foi adaptado para o uso em microchips de poliéster-toner (PT). Além da extração, a amplificação e separação de DNA também foram realizadas em microchips de PT. O processo convencional de fabricação dos dispositivos de PT produz canais com 12 µm de profundidade. Este trabalho descreve um novo processo de fabricação dos microchips de PT com canais mais profundos. Uma cortadora a laser de CO2 é usada para definir a estrutura desejada no filme de poliéster recoberto com toner. Estes filmes de poliéster recobertos com toner e os canais recortados são utilizados com partes intermediárias no microchip. A tampa e a base (filmes de poliéster) são laminadas juntamente com as partes intermediárias. Desta forma microchips com canais mais profundos podem ser criados. Microchips com 4 filmes de poliéster (base, tampa, e dois filmes centrais) foram utilizados para realizar dSPE. Estes microchips possuem canais com ~270 µm de profundidade. A dSPE adaptada para os microchips de PT demonstrou ser capaz de extrair eficientemente DNA (~65%), e o DNA purificado apresentou qualidade suficiente para PCR. A PCR realizada em microchips de PT demonstrou que os dispositivos de PT são compatíveis com os reagentes da PCR e o sucesso da reação de PCR foi demonstrado através da amplificação do fragmento de 520 pares de bases do λ-DNA. A possibilidade de manipular diferentes soluções que são necessárias para realizar a extração e a PCR demonstra o grande potencial desta plataforma para realizar análises genéticas. Além da extração e amplificação, a separação também foi demonstrada nos dispositivos de PT. Duas integrações foram feitas nos microchips de PT, dSPE-PCR e PCR-separação. Na primeira integração a dSPE e PCR foram realizadas em uma única câmara, e a amplificação do fragmento de 520 pb do λ-DNA foi demonstrada. Na segunda integração, o dispositivo foi fabricado com espessuras diferentes para os diferentes domínios. No domínio da PCR as câmaras possuem profundidade de ~270 µm de profundidade, e para o domínio da eletroforese os canais apresentam 12 µm de profundidade. A integração realizada sem válvulas foi demonstrada através da amplificação e detecção do fragmento de 520 pb do λ-DNA em um mesmo microchip. Este trabalho demonstra o grande potencial dos microchips de PT para produzir dispositivos descartáveis totalmente integrados para análise genética.