Caracterização molecular e bioquímica da prolina desidrogenase de Trypanosoma cruzi, um possível alvo terapêutico.

• Ano de defesa: 2010
• Autor(a) principal: Vieira, Lisvane Paes
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Trypanosoma cruzi; Biologia Molecular; Enzimas; Enzime; Glutamates; Glutamatos; Molecular Biology; Prolina desidrogenase; Proline dehydrogenase; Proline-glutamate pathway; Tripanosomatidae; Via prolina-glutamato
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42135/tde-09122010-102717/

Os nossos resultados demonstraram a atividade enzimática prolina desidrogenase (PRODH) do produto do gene anotado como codificante de uma prolina oxidase na base dados do genoma de Trypanosoma cruzi. A atividade da proteína codificada por esse gene foi avaliada inicialmente por complementação de uma linhagem de S. cerevisiae deficiente na expressão funcional da PRODH endógena, e posteriormente mediante a obtenção da enzima recombinante ativa expressa em um sistema bacteriano. Nos estudos feitos tanto com leveduras complementadas com o gene PRODH, quanto com as formas epimastigotas de T. cruzi, observamos que nesses organismos há uma correlação positiva entre o nível intracelular de prolina livre e a resistência ao estresse oxidativo. Através dos ensaios de RT-PCR quantitativo observamos que o RNAm do gene da PRODH é regulado ao longo do ciclo de vida do T. cruzi, com maior nível de expressão no estágio epimastigota intracelular, perfil apresentado também em experimentos de Western Blotting, o que é concordante com o papel fundamental desse aminoácido na diferenciação dessa forma para as forma tripomastigota. Nos diferentes ensaios de localização subcelular observou-se que a proteína PRODH está presente na mitocôndria. A seqüência da PRODH apresenta um sítio EF-hand de ligação a Ca2+. Mostramos experimentalmente a funcionalidade desse sítio e a sua função na regulação da atividade por Ca2+. Em ensaios de respiração mitocondrial, utilizando prolina como substrato, foi mostrado que a prolina fornece elétrons à cadeia respiratória através da PRODH, transferindo elétrons e gerando FADH2 no mesmo nível e com a mesma eficiência que o complexo II (succinato desidrogenase). O análogo de prolina T4C, inibidor do transporte de prolina, causa uma diminuição do conteúdo de prolina livre intracelular, o que foi relacionado com uma diminuição significativa da sobrevivência do parasito em combinação com o estresse nutricional e oxidativo, mostrando a participação do metabolismo de prolina na resistência a esses estresses. Todos esses dados sugerem ademais que o transportador de prolina do parasita pode ser um alvo para drogas terapêuticas de interesse quando combinada com outras drogas que agem via geração de espécies reativas de oxigênio.