A resposta transcricional imediata ao hormônio juvenil no corpo gorduroso de larvas de Apis mellifera

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Schefer, Matheus Afonso
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Apis mellifera; Atividade mitocondrial; Expressão gênica; Gene expression; Hormônio juvenil; Juvenile hormone; Mitochondrial activity; Next generation sequencing; Sequenciamento de nova geração
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-19082020-092954/

A diferenciação das castas na abelha melífera Apis mellifera é regulado pela interação do hormônio juvenil (HJ) com as vias de sensoriamento de nutrientes (IIS, TOR e EGFR) e, através da sinalização de hipóxia, associada a uma dinâmica mitocondrial castaespecífica no corpo gorduroso, que é o centro metabólico dos insetos. Larvas de rainhas apresentam maiores títulos de HJ e maior taxa respiratória que larvas de operárias. No entanto, não sabemos como esses fatores são funcionalmente conectados. Nesse projeto investigamos a resposta transcricional e fisiológica imediata do HJ em larvas operária, especificamente no corpo gorduroso. A hipótese foi que a aplicação tópica deste hormônio em larvas operárias possa mimetizar as condições endógenas observadas em rainhas. No primeiro experimento, larvas de operárias do quarto (L4) e quinto instar inicial (L5F2) foram coletadas de favos e transferidos para um sistema de criação in vitro. No experimento, 3 grupos experimentais foram definidos. No primeiro grupo, larvas receberam uma aplicação tópica de 10 µg de HJ-III sintético em 2 µL de acetona. O segundo grupo recebeu quantidade igual de solvente e o terceiro grupo foi mantido como não tratado. Após 1, 6 e 24 horas, o corpo gorduroso dessas larvas foi dissecado para extração de RNA e síntese de cDNA para quantificação dos níveis de transcritos por RT-qPCR dos seguintes genes: Kr-h1, o gene de resposta imediata à HJ como controle da eficiência do tratamento, genes candidatos de dinâmica mitocondrial (ERR, TOR, TFB2, FOXO, OPA1 e FIS1) e hipóxia (Sima, Fatiga). Para averiguar a influência do hormônio na eficiência mitocondrial, foi realizado experimento de respirometria de alta resolução, e avaliamos também a morfologia das mitocôndrias do corpo gorduroso por meio de microscopia eletrônica de transmissão. No segundo experimento os perfis de expressão gênica no corpo gorduroso de larvas L5F2 tratados ou não com HJ foi avaliada por RNA-seq seguido de análises de bioinformática para identificação de genes diferencialmente expressos. Referente ao experimento 1, apenas os genes Estrogenrelated receptor (ERR) e OPA1 apresentaram uma resposta imediata significativa ao tratamento com HJ. Nas análises morfofisiológicos das mitocôndrias, as análises de respirometria de alta resolução não evidenciaram diferença no consumo de oxigênio como resposta direta ao HJ. No entanto, observou-se uma resposta ao HJ na morfologia das mitocôndrias, que sofriam modificações estruturais imediatas, mas logo retornavam ao normal, com o possível efeito de proteção mitocondrial da proteína OPA1. No segundo experimento, os resultados de RNA-seq mostraram diversos genes com resposta imediata ao HJ, entre estes, genes relacionados com a via de biossíntese do próprio hormônio, como também genes relacionadas à sinalização por ecdisona, metabolismo energético e diversas vias de sinalização de resposta a nutrientes. Também observamos uma ampla quantidade de transcritos diferencialmente expressos, para quais não há informações funcionais disponíveis. Concluímos, portanto, que, ao contrário da nossa hipótese, o HJ não age diretamente a nível fisiológico nas mitocôndrias, mas influencia consideravelmente o perfil transcricional do corpo gorduroso das larvas, dando pistas interessantes para futuras investigações.